痛泻安脾汤对腹泻型肠易激综合征模型大鼠5-HT和NPY蛋白表达的影响

马 军 宋雨鸿 张丽华

广州市第一人民医院中医科，广东广州 510180

肠易激综合征（IBS）是一种以腹痛或腹部不适为特征的肠道功能紊乱的慢性疾病。我国IBS发病率为5%[1]，而腹泻型肠易激综合征（IBS-D）是临床上较为常见的类型。中医认为IBS-D多属于肝失疏泄、肝郁脾虚、脾气渐虚范畴[2]。国内外资料显示，IBS-D患者多伴有焦虑、烦躁、抑郁等植物神经功能紊乱症状，精神状态可影响IBS-D发病及病情进展，这与中医肝郁脾虚学联系密切。5-羟色胺（5-HT）是一种参与脑-肠轴的重要神经介质，而神经肽Y（NPY）是一种脑肠肽，具有神经递质和激素双重功能的多肽，5-HT和NPY在IBS-D发病中起重要作用[3-4]。本研究采用痛泻安脾汤干预IBS-D模型大鼠，了解其对5-HT和NPY含量的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物

健康SPF级SD大鼠40只，体重为280～300g，雄雌各20只，购于广东省医学实验动物中心，实验动物中心动物合格证号：0093643。动物及实验条件均符合国家科学技术委员会制定《实验动物管理条例》。动物饲养于医院清洁级实验动物房，动物房恒温恒湿，温度控制在20～25℃之间，食物和饮水由动物自由摄取。动物购回后饲养2周适应实验环境后方开始实验研究。

1.2 主要试剂及仪器

显微镜、恒温水浴箱、冷冻干燥机、低温自动平衡离心机，NPY和5-HT ELISA试剂盒购于武汉华美生物工程有限公司。

1.3 药物制备

痛泻安脾汤提取液：薏苡仁、白芍、党参、茯苓、防风、炒白术、陈皮、乌药、当归、白扁豆、石菖蒲、甘草、全蝎，按10∶ 10∶ 5∶ 5∶ 5∶ 5∶ 3.3∶3.3∶ 3.3∶ 3.3∶ 3.3∶ 2∶ 1比例称取适量药材，以10倍70%乙醇加热提取2次，每次时长2h，过滤并合并滤液，减压蒸馏回收乙醇，并调整质量浓度为含生药1.5g/mL。盐酸洛哌丁胺胶囊（河南中杰药业有限公司，H20003271）内容物溶于0.9%氯化钠注射液，调配成浓度为0.108g/mL，保存在4℃冰箱待用。

1.4 造模

采用番泻叶灌胃泻下法加束缚应激刺激复制大鼠模型。造模大鼠以调配好浓度为200%番泻叶溶液，按20mL/kg剂量灌胃。每次灌胃后1h，使用透明胶带束缚大鼠肩部、胸部及前肢，限制前肢抓搔面部，使其出现烦躁，不限制其余活动，束缚时间约2h。持续造模2周。空白组在此期间以生理盐水灌胃，且不给予任何束缚干预。以体重变化、腹泻率、腹泻指数等为主要指标评价造模效果。造模后模型组大鼠体重增加缓慢、腹泻率达到100%，腹泻指数明显增加，同空白组比较，差异有统计学意义，提示造模成功。

1.5 给药

造模2周后，模型组、盐酸洛哌丁胺组和痛泻安脾汤组仍按造模方案灌胃番泻叶溶液，灌胃1h后，模型组以生理盐水灌胃，盐酸洛哌丁胺组给药剂 量 1.08g/（kg·d），给 药 体 积 20mL/（kg·d），痛泻安脾汤组给药剂量30g/（kg·d），给药体积20mL/（kg·d）。灌胃1h后，给予束缚干预2h。空白组大鼠全程给予等量生理盐水灌胃，且不给予任何束缚干预，每日1次，连续2周。

1.6 指标检测

末次给药24h后，以10%水合氯醛皮下麻醉大鼠，取腹主动脉血液，离心分离血清待用，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清神经肽Y（NPY）、5-羟色胺（5-HT）含量。取血后，迅速取出大鼠下丘脑组织和一段长度约2cm的结肠组织，制成长度约1cm标本。下丘脑、结肠组织经常规脱水、包埋、切片、二甲苯脱腊后乙醇水化，抗原修复后分别加入一抗（1∶ 100）4℃过夜，PBS洗3次，滴加生物素化山羊抗大鼠IgG，孵育20min，PBS洗3次，滴加SABC试剂，孵育30min，再以PBS洗3次。DAB显色剂室温显色，镜下控制反应时间，苏木精复染，脱水、透明、封片，以400倍显微镜观察。

1.7 统计学方法

采用SPSS20.0统计软件处理分析数据，定量资料以（x±s）表示，采用t检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清5-HT和NPY含量比较

模型组大鼠血清5-HT和NPY含量均较空白组升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；盐酸洛哌丁胺组和痛泻安脾汤组大鼠血清5-HT和NPY含量均较模型组降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；痛泻安脾汤组大鼠血清NPY含量降低幅度较盐酸洛哌丁胺组大，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2 痛泻安脾汤对大鼠肠道中5-HT表达的影响

模型组大鼠回盲部和结肠远端5-HT阳性细胞数量显著较空白组增多，免疫组化染色强度显著增强，差异有统计学意义（P＜0.05）；痛泻安脾汤组和盐酸洛哌丁胺组大鼠回盲部和结肠远端5-HT阳性细胞数量和染色强度均与空白组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；痛泻安脾汤组和盐酸洛哌丁胺组大鼠回盲部和结肠远端5-HT阳性细胞数量均较模型组减少，免疫组化染色强度明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表1 各组血清5-HT和NPY含量比较

表2 痛泻安脾汤对大鼠肠道中5-HT表达的影响

2.3 痛泻安脾汤对大鼠下丘脑、结肠组织NPY蛋白表达影响

模型组大鼠下丘脑和结肠组织NPY蛋白表达均明显较空白组降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；痛泻安脾汤组和盐酸洛哌丁胺组大鼠下丘脑、结肠组织NPY蛋白表达均较模型组上调，且痛泻安脾汤组大鼠下丘脑、结肠组织NPY蛋白表达上调幅度较盐酸洛哌丁胺组大，差异有统计学意义（P ＜ 0.05），见表 3。

3 讨论

中医学认为，IBS-D属于痛泄、泄泻及大肠泄等范畴，与肝脾密切相关。其发病机制尚不完全清除，目前认为主要与内脏感觉、肠道功能紊乱、精神心理因素等有关[5]。胃肠道是体内唯一经中枢神经、自主神经和肠神经共同支配的系统，机体通过脑-肠轴的神经内分泌网调节胃肠功能。经脑-肠轴联系中枢神经系统、肠神经系统和胃肠道反应细胞实现脑肠互动[6]。脑肠肽具有激素和神经递质双重功能，5-HT、NPY、P物质、促肾上腺皮质激素等主要脑肠肽与IBS-D发病密切相关[7-8]，5-HT对胃肠道的蠕动和分泌具有主要的调节作用，可对内脏敏感性和胃肠动力造成影响，中枢和外周5-HT异常表达可诱发IBS症状[9-10]。

表3 痛泻安脾汤对大鼠下丘脑、结肠组织NPY蛋白表达影响

痛泻安脾汤是根据痛泻要方和参苓白术散进行加减而成，方中党参补益脾胃之气，白术、茯苓健脾渗湿，以培土泻木，共为君药。白芍酸苦，微寒，《神农本草经》谓其：“主邪气腹痛……止痛，利小便，益气。”其柔肝缓急以止痛；当归甘辛苦温，养血活血，使血和则肝和，血充则肝柔，共为臣药，君臣配伍可于土中泻木。薏苡仁、白扁豆健脾渗湿，可资健脾止泻之力，共为佐药。陈皮、乌药辛温，理气燥湿，醒脾和胃，为佐药。防风具升散之性，合白芍以助疏散肝郁；伍白术以鼓舞脾之清阳，并可祛湿以助止泻；又为脾经引经药，故兼具佐使之用。全蝎辛平，入肝经，与防风同用以祛风通络、解痉止痛，共为佐药。并佐以石菖蒲燥湿运脾，宁神止痛；甘草补脾和中而调和诸药，为佐使药。诸药相伍，具有补脾柔肝、祛湿止泻、行气活血、解痉止痛之功效。本研究结果显示，痛泻安脾汤能有效的降低IBS-D大鼠血清5-HT和NPY含量，这可能与痛泻安脾汤能改善胃肠功能，并通过脑-肠轴联系中枢神经系统和肠神经系统反馈信息，减少5-HT和NPY生产和释放[11-12]。本研究结果显示，痛泻安脾汤能有效降低IBS-D大鼠结肠组织的回盲端和远端5-HT表达，给予痛泻安脾汤能有效的改善模型大鼠腹泻和腹胀等症状，降低肠道高敏性，使肠道动力紊乱得以改善，可能使肠道微循环血流增加，肠道黏膜炎症反应减轻，从而缓解腹泻、腹胀等症状。结果还显示，痛泻安脾汤能有效的上调下丘脑和结肠组织中NPY表达，可能与痛泻安脾汤能减轻焦虑、烦躁、抑郁等神经症状有关，在中枢神经系统中NPY及其受体调节痛觉具有重要作用，肠道中NPY结合肠黏膜神经节周围行乙酰转移酶，从而对肠道蠕动发挥抑制作用，或是中枢中作用于下丘脑和海马抑制应激和稳定情绪[13-15]，从而改善IBS-D大鼠腹泻症状。

综上所述，痛泻安脾汤可能通过降低腹泻型肠易激综合征模型大鼠血清5-HT、NPY水平，降低肠道5-HT表达，上调模型大鼠下丘脑和肠道NPY蛋白表达而改善腹泻症状。