3种水溶性美白剂的渗透性研究

肖伟莉，王雪梅，闫广义，叶 凤，文国锦

(安徽大学 化学化工学院, 安徽 合肥 230601)

β-熊果苷(β-arbutin)、VC乙基醚(ethyl ascorbic acid )、烟酰胺(nicotinamide)是目前美白护肤品中常用的水溶性美白活性成分，其美白机理各不相同.β-熊果苷主要通过抑制黑色素细胞中的络氨酸酶，阻断多巴及多巴醌的合成来抑制黑色素生成[1].VC乙基醚作为维生素C的衍生物，可以阻止黑色素的氧化过程，抑制黑色素形成，通过影响黑色素形成的多个环节，还原黑色素中间体和黑色素的聚合物，减少多巴和多巴醌类物质形成，抑制黑色素的产生[2-3].烟酰胺作为B族维生素的一员，有别于传统的美白成分，能影响黑素细胞中物质的转运，导致黑素细胞中黑色素合成能力减弱，有效抑制黑色素向角质细胞传递[4].当有部分黑色素已不可避免地达到表层皮肤后，烟酰胺又能通过加速皮肤细胞的更新速度从而促进含有黑色素的细胞脱落，从内到外实现改善肤质、净白肌肤的效果[5].

无论其作用机理如何，美白剂首先要渗透进入皮肤才能发挥其美白功效.因此，研究美白活性组分的透皮情况对评价其美白效果有着重要的意义.目前经皮渗透实验主要用于药物的吸收，有关美白剂的透皮实验研究报道极少.

化妆品的经皮过程与药物的主要区别在于：多数药物是透皮后通过毛细血管作用进入体循环，在作用部位积聚[6]；大多数化妆品功能性成分需要进入皮肤，按产品的有效性作用于皮肤表面或进入表皮或真皮，并在该部位积聚和发挥作用，不需要透过皮肤进入体循环[7].笔者参照经皮给药实验的方法，采用高效液相色谱法通过测定累积透过率与滞留率，对上述3种美白剂进行体外透皮研究.

1 仪器与材料

安捷伦高效液相色谱(Agilent HPLC 1260)，配有自动进样器和二极管阵列检测器(DAD)，美国安捷伦科技有限公司；UV-1750紫外-可见分光光度计，日本岛津公司；AB104-N 电子分析天平，精度0.000 1 g，上海梅特勒-托利多仪器有限公司生产；TP-6型智能透皮试验仪，天津市鑫洲科技有限公司；电热恒温干燥器，上海精密科学仪器有限公司；数显恒温水浴锅，金坛金城国盛实验仪器厂；JK-3200B型超声清洗器，合肥金尼克机械制造公司；纳晶，苏州纳通生物纳米技术有限公司.

β-熊果苷(ABT)、VC乙基醚(EAA)、烟酰胺(NAA)、氮酮、聚二甲基硅氧烷(350-CS)、合成角鲨烷(IBIP)、辛酸/癸酸甘油三酯(GTCC)、碳十六十八醇(C16-18醇)、甘油(GC)、聚氧乙烯(100)硬脂酸酯(PEG-100)、失水山梨醇硬脂酸酯(Span-60)、聚氧乙烯单硬脂酸失水山梨醇酯(Tween-60)、羟乙基纤维素(HEC)，均为化妆品级；甲醇，色谱纯；SPF级昆明种雄性小鼠，(20±2)g，购于安徽医科大学实验动物中心.

2 实 验

2.1 色谱条件

根据文献[8-9]选择色谱条件，色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18柱(100 mm×4.6 mm，3.5 μm)，流动相：甲醇-水(10∶90，v/v)，双泵；流速：1 mL·min-1，进样量：10 μL，柱温30 ℃. ABT、EAA、NAA的检测波长分别选择为280, 245, 260 nm；保留时间分别为 1.28, 4.27, 2.24 min.

2.2 标准工作曲线的建立

精确称取 ABT、EAA、NAA并配置成质量浓度均为10 mg·mL-1的溶液作为母液.依次稀释成20，60，150，300，400，500 μg·mL-1的ABT系列标准溶液；5，20，40，150，300，400 μg·mL-1的EAA系列标准溶液；5，40，100，300，600，800 μg·mL-1的NAA系列标准溶液.在2.1色谱条件下进样得到3种样品的标准曲线.

2.3 待测液的制备

水溶液：精确称取ABT、EAA、NAA并配置成质量分数均为1.0%的水溶液ABT1、EAA1、NAA1.

乳液：按照表1的配方，将ABT、EAA以及NAA 3种美白剂分别加入其中，制得质量分数均为1.0%的乳液ABT2、EAA2、NAA2.

表1 乳液配方

样品促渗剂溶液的制备：在上述水溶液与乳液的制备过程中将氮酮(1.0%)加入其中，分别得到水加促渗剂溶液ABT3、EAA3、NAA3，以及乳液加促渗剂溶液ABT4、EAA4、NAA4.

2.4 体外经皮实验

取同一批(30只)健康的SPF级昆明种雄性小鼠(20±2) g，脱颈处死，取其腹部皮肤，统一保存.实验前，随机选取厚度相近的鼠皮去除脂肪层，刮去小鼠表皮的鼠毛，用生理盐水洗净[10]，小鼠皮肤固定在扩散池和接收池之间，角质层面向扩散池，真皮层面向接收池，且与池中溶剂刚好接触，以防止有气泡产生.接收池的体积为15 mL，取待测液1 g置于扩散池中，在预先加入磁力搅拌子的接收池中加入蒸馏水，并将接收池放在智能透皮试验仪的磁力搅拌器上，设置水浴温度37 ℃，搅拌速率350 r·min-1，每隔2 h，通过取样口取样(同时补充等量的接收液)，经0.22 μm 微孔滤膜过滤后进行色谱分析，计算累积透过率[11].试验结束后，关闭仪器，取下鼠皮，用蒸馏水擦拭并冲洗表面，置于滤纸上常温晾干后，用剪刀将鼠皮剪碎，并移到小烧杯中，蒸馏水超声提取30 min后浸泡24 h，提取液经0.22 μm 微孔滤膜过滤后进样测定，计算不同渗透时间的皮肤滞留率[12].

2.5 美白活性成分的累积透过率随时间的变化曲线

在体外经皮实验中，在2，4，6，8，10，12 h分别取3种美白剂的接收液进样，得到ABT、EAA、NAA在不同时间的累积透过量并绘制出累积透过率随时间变化的曲线.

2.6 供给液剂型的改变对美白剂渗透性的影响

取3种美白剂的水溶液和乳液各1 g，通过2.4中的体外经皮实验，探讨它们的渗透性.

2.7 加入促渗剂后对美白剂渗透性的影响

取加入氮酮的3种美白剂水溶液和乳液各1 g，通过2.4中的体外经皮实验，探讨促渗剂对各美白剂的渗透性影响.

2.8 鼠皮条件的改变对美白剂渗透性的影响

用纳晶在鼠皮的表皮层进行处理(纳晶片在鼠皮上来回作用3次)，将处理后的鼠皮按照2.6中的实验方法，研究3种美白剂的水溶液、乳液在纳晶处理过的鼠皮上的渗透性.此时对应的美白剂水溶液记为ABT5、EAA5、NAA5，美白剂乳液为ABT6、EAA6、NAA6.

2.9 数据处理

按如下公式计算累积透过率与滞留率[13-14]

其中：Qn为累积透过量(mg)，qj为滞留量(mg)；cn为第n次取样时接受液的质量浓度(mg·mL-1)；cj为滞留量的浓度(mg·mL-1)；V0为接收池体积(mL)，Vi为取样体积(mL)，V为鼠皮提取液的体积(mL)；Tn为累积透过率(%)，T为滞留率(%)；M为作用在鼠皮上美白剂的总质量(mg).

3 结果与讨论

3.1 标准曲线的绘制

将3种美白剂的系列标准溶液依次进样，以标样浓度为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归，得到3种物质的线性回归方程以及相关系数，结果列于表2.

表2 β-熊果苷、VC乙基醚和烟酰胺的线性方程、线性范围和相关系数

3.2 美白剂的渗透性随时间的变化

图2为3种美白剂在水溶液中的累积透过率随时间的变化曲线.

图1 3种美白剂的累积透过率曲线

由图1可以看出，随渗透时间的延长，3种美白剂的累积透过率均逐渐增大，烟酰胺的累积透过率明显大于其他两种美白剂.渗透8 h时，ABT、EAA、NAA的累积透过率分别为50.2%，43.4%，61.0%；渗透12 h时，分别达到59.5%，54.1%，68.9%.考虑到护肤品在皮肤上的停留时间，以下实验的渗透时间均选择8 h.

3.3 美白剂在不同剂型中的渗透性

3种美白剂在不同剂型中的累积透过率、滞留率随时间变化情况见表3～4.

表3 3种美白活性剂水溶液的累积透过率与滞留率

表4 3种美白活性剂乳液的累积透过率与滞留率

由表3、4可见，无论是在水溶液还是乳液中，随着渗透时间的延长，3种美白剂累积透过率和滞留率均呈现递增趋势；同样的渗透时间，烟酰胺的累积透过率最大，VC乙基醚最低；熊果苷的滞留率最大，烟酰胺的最低.对于单个的美白剂来说，水溶液中的累积透过率均大于乳液中的累积透过率，而滞留率均小于乳液中的滞留率；渗透8 h后，水溶液中的累积透过率与滞留率分别为50.2%, 6.7%(ABT)；43.4%, 1.9%(EAA)；61.0%, 3.0%(NAA).乳液中的累积透过率与滞留率分别为14.0%, 9.6%(ABT)；25.7%, 4.3%(EAA)；45.0%, 4.5%(NAA).

人体皮肤角质层中的含水量大约在20%，其中25%～ 35%的水是结合水，其余的为自由水，角质层中存在一个水样的小孔通道，水在促渗系统的研究中也被看作是一种促渗剂，因而增加组织的水化作用能够提高水溶性活性组分的渗透性[15]；对于乳液系来说，油脂和增稠剂的加入使乳液系的稠度和黏度均明显增加，使得其渗透性弱于水溶液.即在水溶液中有利于这3种美白物质的渗透，乳液则更有利于这3种美白物质在皮肤中累积.

3.4 氮酮对3种美白剂渗透性的影响

在经皮给药实验中为了使药物更好地进入皮肤，往往都会选择添加一定的促渗剂来达到预期的目的.氮酮是一种新型高效、无毒、无刺激性的透皮吸收促进剂，对亲水性和疏水性成分均有较好的促渗作用[16].氮酮作为一种能够促进活性组分向皮肤中渗透的物质，是由于其能够溶解角质层中的脂质，从而改变角质层的结构，促进活性组分的吸收[15].

表5、6为加入氮酮后3种美白剂的累积透过率与滞留率.

表5 3种加促渗剂氮酮的美白活性剂水溶液的累积透过率与滞留率

表6 3种加促渗剂氮酮的美白活性剂乳液的累积透过率与滞留率

由表5、6与表3、4相比较可看出，水溶液与乳液在加入氮酮后累积渗透率均随着渗透时间的延长而增加，但滞留量相较于未加氮酮之前却有所减少.

通过观察3种美白剂的累积渗透率发现，随着渗透时间的延长，氮酮对3种美白剂的促渗作用有所不同.与表3、4中不加氮酮的水溶液、乳液相比，加入氮酮后，ABT水溶液渗透2 h时的增加幅度最大(54.8%)，乳液则在8 h时的增加幅度最大(51.3%)；EAA水溶液在4 h的增加幅度最大(54.1%)，乳液在8 h的增加幅度最大(17.7%)；NAA水溶液在4 h增加幅度最大(33.5%)；乳液在2 h的增加幅度最大(25.0%).说明氮酮更有利于ABT的渗透，更有利于水溶液中活性组分的渗透，即氮酮对水溶性药物促渗作用较强[17].

3.5 鼠皮经纳晶处理后的渗透性分析

纳晶，又称作纳米晶片，作为一种新型的促渗美肤工具逐渐被人们所熟知.它与皮肤的作用面由许多直径小于100 nm的纳米针组成.在很短的时间中，纳晶能够跟微针一样，在皮肤表面打开非常多的细小的通道[18]，从而达到促进活性组分吸收的目的.与传统的一些传输方式相比，它具有操作简单方便、无痛等优点[19].

表7、8为鼠皮经纳晶处理后3种美白剂水溶液、乳液的累积透过率与滞留率随时间变化情况.

表7 3种美白活性剂水溶液在经纳晶处理后的鼠皮上的累积透过率与滞留率

表8 3种美白活性剂乳液在经纳晶处理后的鼠皮上的累积透过率与滞留率

由表7、8可看出，鼠皮经纳晶处理后，随着渗透时间的延长，3种美白剂的滞留率略有减少；累积透过率在逐渐增加.但不同剂型、不同渗透时间，其增加的幅度有所不同.与表3、表4中未处理的水溶液、乳液相比，ABT渗透2 h后累积透过率的增加幅度最大，在水溶液中达32.9%，在乳液中为14.9%；EAA水溶液在2 h的增加幅度最大(23.5%)，乳液在8 h的增加幅度最大(20.3%)；NAA水溶液在4 h的增加幅度最大(25.7%)，乳液在2 h时的增加幅度最大(11.8%).可见纳晶处理鼠皮后更有利于水溶液中ABT的渗透.

在经纳晶处理后短时间内皮肤的通道得以打开使得累积透过率变化较明显.但随着时间的延长以及皮肤自身的作用，细小的通道又发生闭合[20].经纳晶处理后，3种美白剂的累积透过率在水溶液中的增加相较于乳液要明显，而滞留率的变化很小且不明显，说明纳晶处理更有利于水溶液中活性组分的渗透，而对微米级的乳化颗粒促渗效果并不显著.

4 结束语

笔者通过体外经皮实验对3种水溶性美白剂 β-熊果苷、VC乙基醚和烟酰胺的渗透性进行了研究.由实验结果看出：水溶液中，相同渗透时间烟酰胺的累积透过率最大；3种美白剂的累积透过率和滞留率均随着渗透时间的延长而增加；同一物质在水溶液中的累积透过率高于乳液中的，滞留率小于乳液中的.由此可见，水溶液有利于活性物质透过皮肤，而乳液剂型更有利于其在皮肤中累积.加入氮酮、预先用纳晶处理鼠皮等方式均可增大各组分的渗透率，但同时滞留量也均有所减少.氮酮的促渗性能总体上要好于纳晶处理.氮酮对亲水性和疏水性的化合物都能增强其透皮作用，在日常生活及生产中用途广泛，但由于其对酸碱不稳定，可能会使配方中油水分离，因此对于产品的稳定性可能产生影响.纳晶属于一种新型的促渗手段，虽然使用较为繁琐，促渗效果也弱于氮酮，但从安全护肤的角度来说不失为一个更好的选择.