VEGF、MMP-9在卵巢癌组织中的表达及贝伐单抗联合顺铂对卵巢癌细胞SKOV3的作用

刘 端，李红雨，臧星卉，鱼志琪，孙 玮，李玉光

郑州大学第三附属医院妇产科 郑州 450052

卵巢癌是女性生殖器常见的三大恶性肿瘤之一，早期病变不易发现，晚期缺乏有效的治疗手段，致死率位居妇科恶性肿瘤之首[1]。目前主要采用以手术为主的综合治疗，包括放疗和化疗等，但5 a生存率仅为20%～25%[1]。随着对卵巢癌发生发展分子生物学机制的研究，新的治疗靶点不断出现。其中，血管靶向治疗是目前热点之一，尤其是血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)单克隆抗体贝伐单抗[2]，其次与侵袭相关的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)家族也受到了极大的关注[3]。本文旨在了解卵巢癌组织中VEGF、MMP-9的表达情况以及贝伐单抗联合顺铂对卵巢癌细胞的作用机制，为卵巢癌的临床治疗提供可靠的理论依据。

1 材料与方法

1.1研究对象选择2015年9月至2017年6月在郑州大学第三附属医院妇科住院并经病理检查确诊的101例患者。其中：上皮性卵巢恶性肿瘤患者41例(卵巢癌组)，年龄28～75岁，中位年龄47岁，术前未接受放化疗；卵巢良性肿瘤患者30例(卵巢良性肿瘤组)，年龄20～72岁，中位年龄45岁；因良性子宫病变行卵巢切除的患者30例(对照组)，年龄50～70岁，中位年龄55岁。卵巢癌组、卵巢良性肿瘤组与对照组年龄比较，差异无统计学意义。

1.2主要试剂免疫组化试剂均购于北京中杉金桥生物技术有限公司；贝伐单抗购于瑞士罗氏公司；顺铂购于齐鲁制药有限公司；兔抗人VEGF、MMP-9、AKT、Bad单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠/兔IgG抗体购于美国CST公司；Western blot化学发光液购于美国Millipore公司；BCA蛋白定量试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒购于江苏碧云天生物技术研究所。

1.3 3种卵巢组织中VEGF、MMP-9蛋白表达的检测采用免疫组化法检测3种组织中VEGF、MMP-9蛋白的表达情况。将制备好的石蜡组织切片置于二甲苯中脱蜡，再经乙醇梯度水化后，放于枸橼酸钠抗原修复液中加热，用体积分数为3%过氧化氢孵育，灭活内源性过氧化氢酶。然后滴加体积分数为10%山羊血清封闭30 min，加入鼠源抗VEGF、MMP-9一抗过夜，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育30 min。滴加DAB显色液，显微镜下控制反应时间，当阳性部位出现特异性显色而背景无着色时，终止显色。然后用苏木素进行复染，盐酸乙醇分化液分化，蓝化液蓝化，梯度无水乙醇逐级脱水，二甲苯透明，最后用中性树胶封片，在400倍光学显微镜下选取5个视野拍照。免疫组化结果判定标准如下。按着色强度评分：无着色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；按阳性细胞百分比评分：无阳性细胞为0分，阳性细胞<25%为1分，25%～为2分，50%～为3分，75%～为4分。结果取2项评分的乘积，0～1分为蛋白阴性表达，≥2分为蛋白阳性表达。

1.4细胞及培养人卵巢癌细胞系SKOV3由第四军医大学病原生物学教研室赵亚教授惠赠。细胞在含有体积分数为10%胎牛血清(美国Gibco公司)、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素(碧云天公司)的RPMI 1640培养液中培养，细胞密度达到80%～90%时，用2.5 g/L胰蛋白酶-EDTA消化并传代。

1.5细胞活性检测取对数生长期的卵巢癌细胞SKOV3，用2.5 g/L胰蛋白酶-EDTA消化并计数，按照2 000个/孔的密度接种于96孔板中，在37 ℃、体积分数为5% CO2中培养24 h后，将2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mg/L的贝伐单抗加入到96孔板中，每个浓度设置6个平行孔，同时设置无药物处理组及无细胞空白对照组，药物作用48 h。每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)放于37 ℃恒温箱中继续孵育4 h。然后弃上清，每孔加入150 μL DMSO溶液,用酶标仪检测570 nm处的吸光度(A)值。存活率=(加药组A值-空白对照组A值)/(无药物处理组A值-空白对照组A值)×100%，并计算IC50。

1.6细胞凋亡率检测采用Annexin V-FITC和PI双染法结合流式细胞术检测贝伐单抗单独及联合顺铂对SKOV3细胞的凋亡诱导作用。将对数生长期的SKOV3细胞以每孔3×105个细胞的密度接种至6孔板中，置于恒温箱中孵育24 h之后分别加入相应的药物(贝伐单抗5 mg/L、顺铂3 mg/L、贝伐单抗5 mg/L+顺铂3 mg/L)，对照组加入等体积的PBS，48 h后收集细胞，用PBS洗涤2～3遍。根据细胞凋亡检测试剂盒说明书，每管加入500 μL Annexin V-FITC结合液重悬细胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI，轻轻混匀，室温避光孵育10 min。于冰浴中用流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验重复3次。

1.7MMP-9及VEGF信号通路中关键蛋白AKT和Bad蛋白表达的检测采用Western blot法。贝伐单抗5 mg/L、顺铂3 mg/L单独及联合使用处理SKOV3细胞48 h，提取细胞中的总蛋白。用BCA蛋白定量试剂盒定量，取30 μg蛋白，配制体积分数5%浓缩胶、体积分数15%分离胶进行SDS-PAGE电泳，之后将蛋白电转至PVDF膜上。经过封闭(体积分数为5% BSA室温封闭2 h)、与一抗孵育(11 000稀释，4 ℃孵育过夜)、洗涤(TBST洗涤3次，每次10 min)、与二抗孵育(14 000稀释，室温孵育1 h)、洗涤(TBST洗涤3次，每次10 min)后，在膜上覆盖适量化学发光显色液并置于Amersham Imager 600凝胶成像系统中成像、拍照。

1.8统计学处理采用SPSS 19.0进行统计学分析。3种卵巢组织中VEGF、MMP-9蛋白阳性表达率的比较采用χ2检验；卵巢癌组织中VEGF、 MMP-9蛋白表达的关系采用Pearson相关进行分析；贝伐单抗单独及联合顺铂使用时卵巢癌细胞SKOV3凋亡率的比较采用2×2析因设计的方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1不同类型卵巢组织中VEGF、MMP-9蛋白的表达与对照组、卵巢良性肿瘤组比较，卵巢癌组VEGF、MMP-9蛋白阳性表达率升高(图1、表1)。卵巢癌组织中VEGF、MMP-9蛋白的表达呈正相关(表2)。

A:正常卵巢组织；B：卵巢良性肿瘤组织；C:卵巢癌组织；1：VEGF蛋白；2：MMP-9蛋白图1 3种卵巢组织中VEGF、MMP-9蛋白的表达(SP,×400)

表1 3种卵巢组织中VEGF、MMP-9蛋白表达的比较

*：与卵巢癌组相比，P<0.001

表2 卵巢癌组织中VEGF、MMP-9蛋白表达相关性分析 例

χ2=6.034，P=0.014，rp=0.360

2.2贝伐单抗对卵巢癌细胞SKOV3的体外增殖抑制作用贝伐单抗对卵巢癌细胞SKOV3的增殖抑制作用随着浓度的增加而增强，呈剂量依赖性(图2)，IC50为(8.89±0.27) mg/L。

图2 贝伐单抗对卵巢癌细胞SKOV3的体外增殖抑制作用

2.3 4组SKOV3细胞凋亡率的比较结果见表3。

表3 4组SKOV3细胞凋亡率的比较 %

F贝伐单抗=187.892，F顺铂=404.224，F交互=161.284，P均<0.001

2.4贝伐单抗联合顺铂对MMP-9及VEGF信号通路中AKT、Bad蛋白表达的影响结果见图3。

1～4：分别为对照组、贝伐单抗组、顺铂组、贝伐单抗+顺铂组

图3贝伐单抗联合顺铂对VEGF、MMP-9、p-AKT、AKT、Bad蛋白表达的影响

3 讨论

VEGF在肿瘤的发生发展过程中促进新生血管的生成[4]，为肿瘤提供必需的氧气和营养物质[5-7]。MMP-9能够降解细胞外基质和基底膜，帮助肿瘤细胞进入血液循环，也可以支持肿瘤细胞外渗和转移[8-9]，MMP-9与血管生成及肿瘤侵袭能力密切相关，这对肿瘤的生长和转移起到非常重要的作用[10-12]。在本研究中作者发现，卵巢癌组织中VEGF、MMP-9蛋白的阳性表达率比卵巢良性肿瘤组及对照组高，且二者呈正相关，提示二者可能成为卵巢癌治疗的联合作用靶点。

贝伐单抗是重组的人源化单克隆抗体，主要与VEGF-A结合，抑制VEGF与其受体的结合，从而抑制肿瘤血管的生成[13]。目前，FDA已批准贝伐单抗用于转移性结直肠癌、转移性乳腺癌、晚期非小细胞肺癌的一线治疗。除此之外,贝伐单抗在肝癌、胃癌、卵巢癌等恶性肿瘤的应用也取得较好的临床疗效，尤其是和化疗药物联合使用时[14-16]。研究[17-18]发现，贝伐单抗在单独使用时随着其浓度的递增，U87胶质瘤细胞所分泌的MMPs逐渐增多，增强了细胞的迁移和侵袭能力。在动物实验[17]中，相比贝伐单抗的短期治疗，其长期治疗使肿瘤细胞表现出更强的迁移和侵袭能力。在本研究中Western blot结果显示，贝伐单抗单独作用于SKOV3细胞时并未减弱与侵袭相关的MMP-9蛋白的表达，但也没有表现出增强的趋势，贝伐单抗长期作用于卵巢癌细胞之后，MMP-9蛋白的表达水平是否有增加，还有待进一步的研究。另外，有学者[17]通过贝伐单抗和MMP抑制剂的联合干预，成功降低了胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力。在本实验中作者采用贝伐单抗联合顺铂对卵巢癌细胞进行处理，凋亡结果显示，贝伐单抗的单独使用并未引起细胞的明显凋亡，顺铂单独使用时引起细胞的凋亡率也仅有13 %左右，但是两者联合使用后细胞的凋亡率明显增加，说明二者的联合使用在诱导卵巢癌细胞凋亡方面起到了良好的协同效应。同时Western blot结果也证实，贝伐单抗和顺铂单独处理组与对照组相比促凋亡蛋白Bad的表达增强，在联合用药组中Bad表达增强更明显。接下来作者对VEGF下游信号通路中的关键蛋白AKT进行了检测，结果显示，贝伐单抗单独作用于卵巢癌细胞时可减弱AKT的磷酸化水平，这说明贝伐单抗抑制了VEGF与其受体的结合，并抑制了下游信号通路的传导，在联合用药组中效果更加明显。Bad是一种促凋亡蛋白，其过表达可促进细胞凋亡。Western blot结果显示，贝伐单抗单独使用组可增强凋亡蛋白Bad的表达，与顺铂联合使用后效果更明显，而此时更值得注意的是MMP-9蛋白的表达有了明显的减弱。由此作者推断，贝伐单抗联合顺铂可协同抑制VEGF下游信号通路的传导，进而影响MMP-9蛋白的表达。这充分说明贝伐单抗的单独使用虽可影响VEGF下游信号通路的传导，进而诱导细胞凋亡，但并不能减弱细胞的侵袭能力，而和化疗药物顺铂的联合使用可减弱MMP-9蛋白的表达水平。因此，贝伐单抗联合顺铂有可能成为治疗卵巢癌的一种有效方案。