不同强度运动对大鼠骨骼肌AMPK/PGC-1α信号通路的影响

许 杰,黄巧婷，谢敏豪,严 翊,林家仕

当前，运动医学界已公认有氧运动是改善心肺耐力和预防代谢性疾病的主要干预手段。最近有研究证明，较高的心肺耐力水平可显著降低患心血管代谢性疾病的风险和全因死亡率。另外该研究还提出，与药物相比，在同一时间段内心肺耐力(cardiorespiratory fitness ,CRF)的改善对治疗上述疾病更为有效，因为有氧能力的增加意味着在从事较大强度的运动或工作时，机体耐受力更强[1]。与此同时，大量研究探讨了心肺耐力改善的生物学机制，其中过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子 1(peroxisome proliferators γ activated receptor coati vator-1-α，PGC-1α)是众多学者关注的热点。线粒体的生物合成和功能体现，以及有氧代谢水平都与PGC-1α息息相关[2-4]。早期研究已通过转基因小鼠模型证实PGC-1α基因过度表达的小鼠最大摄氧量和有氧能力增加，小鼠在运动测试中完成的负荷更大[5]。还有研究发现，PGC-1α转基因小鼠的摄氧量水平要比普通小鼠高24%，而全身和骨骼肌特异性PGC-1α敲除小鼠的运动能力出现明显下降[6]。提示PGC-1α表达量的增加能够有效提高有氧运动能力和峰值摄氧量。另有研究发现，5′单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)作为PGC-1α的上游调控因子，对维持细胞内能量平衡起重要作用[7]，且AMPK可以增强PGC-1α的转录活性[8]。因此，AMPK是当前研究运动诱导PGC-1α信号级联的主要靶点。

运动可引起线粒体产生适应性变化，比如线粒体生物合成增加，酶活性增加等，这种适应与运动强度关系密切[9]，线粒体生物合成的信号转导通路极有可能介导了运动改善心肺耐力的机制。因此，本研究从骨骼肌AMPK/PGC-1α通路着手，研究不同强度运动改善心肺耐力的生物学机制，为改善心肺耐力的有效运动负荷的评价提供理论支持。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象与分组

1.2 运动方案

表1 训练跑台速度Table 1 Training speed

1.3 取材与测试方法

各组大鼠于训练结束后48 h取材。使用2%戊巴比妥钠(0.25 ml/100 g体重)腹腔注射麻醉大鼠，麻醉好后迅速分离右侧比目鱼肌。将分离好的比目鱼肌加入RNA Stabilization Reagent(Qiagen)中，4 ℃过夜后-20 ℃保存。将剩余比目鱼肌于冰上切成小块，迅速投入液氮中，取材完成后将转移至-80 ℃冰箱保存。

RT-qPCR法测定AMPK(Gene ID：78975，上游引物TTTGCCCAGTTACCTCTTT，下游引物CTGGCTTGGTTCATTATTCT)和PGC-1α(Gene ID：83516，上游引物CGGAAATCATATCCAACCAG，下游引物TGAGGACCGCTAGCAAGTTTG)基因表达。使用SV Total RNA Isolation System(Promega)提取RNA，采用紫外分光光度计(岛津，日本)测定A260/280比值，通过查询Primer-BLAST检索出相应基因的引物序列。委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行引物设计生产。使用qPCR Master Mix(Promega)试剂盒在Real-time PCR System(ABI 7500，USA)中进行Real Time PCR反应，反应条件为95 ℃，2 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min，共50个循环。2-△△CT法进行相对定量。

Western Blot法测定AMPK(Ab80039，Abcam)、磷酸化AMPK(Ab133448，Abcam)和PGC-1α(Ab54481，Abcam)蛋白表达。内参蛋白选择甘油醛-3-磷酸脱氢酶( glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)。用Image Lab计算出目的条带的相对含量值。

1.4 统计方法

使用SPSS 16.0对数据进行统计分析。所有实验数据用平均数±标准差表示。组间采用单因素方差分析进行比较。差异显著性水平定义为P<0.05，非常显著性水平定义为P<0.01。

2 研究结果

2.1 不同强度运动对大鼠比目鱼肌PGC-1α、AMPK mRNA表达的影响

结果显示，小强度组和大强度组PGC-1α mRNA表达显著高于安静组和中强度组。中强度组虽然也高于安静组，但是并无显著性差异。而中强度组AMPK mRNA表达是3个运动组中最高的，显著高于安静组，非常显著高于大强度组(见表2)。

表2 不同组别大鼠比目鱼肌PGC-1α、AMPK基因表达的差异(N=10)Table 2 Differences of PGC-1α and AMPK gene expression in soleus muscle of rats in different groups (N=10)

2.2 不同强度运动对大鼠比目鱼肌PGC-1α、AMPK和磷酸化AMPK蛋白表达的影响

结果显示，中强度组PGC-1α蛋白表达显著高于安静组。另外2个运动组虽高于安静组，但无显著性差异。(见表3、图1)。

表3 各组大鼠比目鱼肌PGC-1α、AMPK、磷酸化AMPK蛋白表达差异(N=10)Table 3 Differences of PGC-1α, AMPK and phosphorylated AMPK protein expression in soleus muscle of rats in each group (N=10)

图1 大鼠比目鱼肌PGC-1α、AMPK和磷酸化AMPK蛋白表达Graph 1 PGC-1α, AMPK and phosphorylated AMPK protein expression in soleus muscle of rats in different groups

3 分析讨论

3.1 不同强度运动对大鼠比目鱼肌PGC-1α基因和蛋白表达的影响

一次性运动和长期耐力运动均能诱导PGC-1α表达增加，早期的研究多集中于一次性运动引起的PGC-1α应激反应。Baar K发现，大鼠经过6 h的一次性游泳训练后，骨骼肌PGC-1 mRNA和蛋白表达同时升高[11]。还有研究通过人体实验发现，一次性2 h的耐力运动后即刻PGC-1α基因表达显著增加[12]。这些研究同时发现PGC-1α及其家族成员对线粒体生物合成作用增加有重要调控作用，这为后续研究PGC-1α与有氧代谢及心肺耐力的关系奠定了基础。在PGC-1α功能确定之后，大量研究开始关注长期运动干预对PGC-1α的影响以及PGC-1α上下游调控因子的变化。Short R等发现，受试者经过16周的有氧自行车运动后骨骼肌PGC-1α基因表达显著增加，同时受试者峰值摄氧量增加幅度平均达到了10%以上。Pilegaard H等[13]的研究设计对比了7名受试者运动腿和非运动腿经过4周训练后的结果，他们发现运动腿的PGC-1α mRNA表达显著高于非运动腿，而且峰值表达量出现在运动后2 h。Russell P等人发现经过6周的耐力训练后，PGC-1α mRNA和蛋白表达均增加了2倍以上[12]。还有研究发现，经过12周有氧耐力和力量训练结合的运动干预方式可使中年受试者股外侧肌PGC-1α蛋白表达显著增加[14]。还有两项研究通过动物实验证实了4周和8周的耐力训练均可以显著增加小鼠骨骼肌PGC-1α mRNA的表达[15-16]。近来的研究确认了PGC-1α在调节能量代谢中的核心作用。有研究发现运动可引起骨骼肌PGC-1α转录上调，从而起到防止线粒体内某些酶含量下降的作用[17]。另有研究表明，运动训练对维持线粒体含量具有重要作用，而这种效果与PGC-1α密不可分[18]。以上多项研究均发现耐力运动能够诱导骨骼肌PGC-1α增加。而且大部分研究同时发现了线粒体生物合成增加、线粒体功能增强、有氧代谢酶活性增加、摄氧量提高等现象。这表明PGC-1α可能在调节和协调能量代谢作用中起着及其重要的作用。早期的研究也做过小动物气体代谢实验，但总体上受实验技术和条件所限，只能探索肌肉有氧代谢酶和最大摄氧量及运动能力的关系[19]。近年来研究方式在分子生物学发展的推动下已经转变为锚定一些代谢调控的重点因子。2008年，Calvo等人通过转基因小鼠模型证实了PGC-1α与运动能力密切相关[5]。该研究明确提出体内骨骼肌PGC-1α的上调能够极大地改善各种锻炼模式下的运动表现和最大摄氧量。随后， Tadaishi的研究团队制作了骨骼肌PGC-1α-b过表达的小鼠。他们发现相比野生型小鼠，该转基因小鼠骨骼肌有氧代谢能力显著提升，这有助于提高小鼠的最大摄氧量和运动能力[19]。

本研究为了探讨运动强度对骨骼肌PGC-1α表达的差异影响，设计了3个运动强度。而且随着大鼠最大摄氧量不断提高，训练时采用的跑速也有所增加。总体来看，本研究选取的3个运动强度都可以使骨骼肌PGC-1α产生一定适应性变化。

结合前人的研究，不难看出运动强度确实会对PGC-1α表达产生影响。只是强度设定不同所产生的结果不一致。本研究选取的中强度和大强度两个负荷最终跑速要比前面几项研究大，而小强度负荷处于适中的水平。这表明中强度运动足够引起骨骼肌PGC-1α蛋白表达增加。而随着运动能力的提升，小强度运动在经过足够长的时间后，也会出现心肺耐力升高的有利信号。这提示我们运动强度可能并非越大越好，因为中低强度的运动可能达到和大强度运动同样的效果。

3.2 不同强度运动对AMPK/PGC-1α信号通路的影响

近年来，也有多项研究报道了耐力运动促进AMPK表达，从而导致线粒体生成和有氧耐力的提高[22-23]。AMPK是对能量变化和能量转换极其敏感的一种激酶，运动应激正是通过AMPK来调节PGC-1α以达到上述效果[24]。研究表明AMPK和PGC-1α之间有极其紧密的关系。AMPK和PGC-1α调节的转录基因大部分是相同的，AMPK可以直接作用于PGC-1α并使其磷酸化，从而增加了PGC-1α的转录活性[25-26]。另外Li等研究表明[21]，小鼠经过12周耐力训练后，AMPK蛋白表达增加，PGC-1α mRNA表达增加，虽然PGC-1α 蛋白表达无显著性变化，但PGC-1α去乙酰化水平非常显著增加，也就是说所激活的PGC-1α增多了。另有一项研究表明，经过36周耐力训练后，大鼠骨骼肌PGC-1α蛋白表达量显著上升。而AMPK蛋白表达量无明显变化[27]。

大部分文献都未详细探讨运动强度对AMPK/ PGC-1α信号通路的影响，只有极少数研究报道了不同运动强度可能干预效果不同。有研究发现，分别以80%和120%乳酸阈强度运动1 h后，较大运动强度的一组受试者其骨骼肌PGC-1α蛋白表达显著增加，但80%乳酸阈强度组升高幅度不大[28]。该研究提出随着运动持续时间增长，ATP/AMP比值下降，磷酸肌酸和肌糖原不断被消耗，此时能量出现暂时亏空，AMPK就会被激活，进而刺激PGC-1α表达增加。前文提到的Oliveira R的研究也发现，相对较大速度的运动干预可以导致磷酸化AMPK和SIRT1表达增加，同PGC-1α变化趋势一致[16]。他们认为较高强度的训练可以有效提高骨骼肌AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表达而这种显著增加的效果是低强度运动达不到的。

4 结论

(1)随着运动强度的增加，骨骼肌AMPK的活化水平增加。

(2)运动强度越大不代表PGC-1α蛋白表达会越高。

(3)中强度运动对AMPK/PGC-1α信号通路的影响可能更有益于心肺耐力的提升。