OSAHS患者缺氧诱导因子1α与血清肺表面活性蛋白水平的变化及意义*

赵 丹，赵远琴，邵松军，刘维佳，张 程，张湘燕△

(1.贵州省人民医院呼吸与危重症医学科/贵州大学医学院,贵阳 550000；2.贵州医科大学在读研究生，贵阳 550000)

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征 (OSAHS) 是常见的睡眠相关呼吸障碍疾病，男性患病率22%，女性17%[1]。其特点是睡眠过程中反复发生的间歇性低氧[2]，由于氧化应激反应激活炎症通路，可导致心、脑血管等多系统损害[3-4]。缺氧条件下缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)激活可导致肝纤维化、心脏炎症细胞凋亡和纤维化[5-6]。此外,OSAHS患者亦存在亚临床肺损伤[7]。在本课题组既往的研究中发现，OSAHS患者肺泡表面蛋白高于正常对照人群，但具体机制仍不甚清楚。本研究拟阐明OSAHS患者HIF-1α信号传导通路上调，启动炎性反应，导致下游的炎症因子释放，引起肺泡上皮细胞损伤，以期揭示OSAHS患者亚临床肺损伤的机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2016年8月至2017年2月贵州省人民医院门诊及住院就诊的睡眠监测患者83例，其中男38例、女25例，年龄22～76岁，平均(47.52±14.43)岁；依据OSAHS诊治指南(2011年修订版)[8]的诊断标准，分为对照组20例、轻度OSAHS组20例、中度OSAHS组23例、重度OSAHS组20例。均排除慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺间质纤维化、恶性肿瘤、结缔组织病、结核病、严重心力衰竭、代谢性疾病及肝、肾功能不全。该研究获贵州省人民医院医学伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1日间爱波沃斯嗜睡评分(ESS)评分 正式进行多导睡眠监测(PSG)前，在安静环境中，运用ESS评估患者白天嗜睡程度。

1.2.2PSG 采用美国飞利浦Alice 5 PSG系统，监测内容包括：脑电图、眼电图、下颌肌电图、心电图、口鼻气流、胸腹部呼吸运动、血氧饱和度(SPO2)、体位、鼾声、胫前肌电图等。监测时间自21:00至次日06:00共9 h。

1.2.3RNA提取及逆转录 PSG后的次日06:00，空腹抽取外周静脉血4 mL，注入肝素抗凝管，Ficoll密度梯度法分离单个核细胞，Trizol一步法提取RNA。测定RNA浓度，按dNTP Mix．2.5 nmol/L Each 4 μL，Primer Mix 2 μL，RNA Template 2 μL，5×RT Buffer 4 μL，DTT 2 μL，HiFScript,200 U/μL 1 μL，RNase-Free Water up to 20 μL，总反应体系20 μL逆转录为cDNA。

1.2.4荧光定量PCR检测 检索GenBank，上海生工设计合成引物:NF-κB上游5′-GCG AGA GGA GCA CAG ATA CC-3′，下游5′-CTG ATA GCC TGC TCC AGG TC-3′。HIF-1α上游5′-GAA AGC GCA AGT CCT CAA AG-3′，下游5′-TGG GTA GGA GAT GGA GAT GC-3′。内参GAPDH上游5′-CAG GAG GCA TTG CTG ATG AT-3′，下游5′-GAA GGC TGG GGC TCA TTT-3′。PCR反应体系：cDNA模板2 μL，25 μL 2×UltraSYBR Mixture(High Rox)上游、下游引物各1 μL，ddH2O 21 μL，总反应体系50 μL。在PCR基因扩增仪上进行热循环。用1.5%琼脂糖凝胶电泳，以DL-2000为标准分子量对照鉴定PCR产物。

1.2.5Western blot法检测 PSG后的次日06:00时，空腹抽取外周静脉血4 mL，注入肝素抗凝管，Ficoll密度梯度法分离单个核细胞，裂解液30 μL裂解样品，超声波裂解3～5次，4 ℃，12 000 r/min离心20 min，取上清液加入Buffer：DTT，煮沸10 min。5 μL上样，聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳后转膜，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，经牛奶封闭后，用一抗(PBS 1∶1 000稀释)，在4℃孵育过夜，TBST洗膜后用HRP标记的羊抗鼠/兔IgG二抗(PBS 1∶5 000稀释)室温下孵育1 h。Milliore公司的显影液显影并拍照分析。

1.2.6酶联免疫吸附试验(ELISA)检测 行PSG后的次日06:00时,空腹抽取外周静脉血4 mL，注入非抗凝管中，室温静置30 min后，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，留取血清。按ELISA试剂盒说明书，从室温平衡20 min后的铝箔袋中取出所需板条，设置标准品和标本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL，标本孔中加入待测标本50 μL，空白对照孔不加。除空白孔外，标准品孔和标本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，白细胞介素-6(IL-6)，Ⅱ型肺泡细胞表面抗原(KL-6)，肺泡表面活性蛋白-A(SP-A)，肺泡表面活性蛋白-D(SP-D)]100 μL，用封板膜封住反应孔，37 ℃恒温箱温育60 min。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加350 μL洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min，每孔加入50 μL终止液，在酶标仪上测定450 nm处的吸光度值A450。

2 结 果

2.1基线比较 各组性别、年龄、颈围、胸围、腰围、BMI、ESS指标比较，随着OSAHS严重程度的增加，轻、中、重度OSAHS组颈围逐渐增大，高于对照组；重度OSAHS组胸围、腰围、BMI高于对照组(P<0．05)。年龄、性别、ESS评分差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2各组NF-κB、HIF-1αmRNA表达水平 采用荧光定量PCR检测，中、重度OSAHS组NF-κB表达水平明显高于对照组，重度OSAHS组HIF-1α mRNA表达水平明显高于对照组(P<0.05)，见图1、2。

a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与轻度OSAHS组比较；c：P<0.05，与中度OSAHS组比较

表2 各组TNF-α、IL-6、SP-A、SP-D水平比较

a：P<0.05，与对照组比较；b：P<0.05，与轻度OSAHS组比较；c：P<0.05,与中度OSAHS组比较

a：P<0.05，与对照组比较

图1各组血清中NF-κB mRNA表达水平

a：P<0.05，与对照组比较

图2各组血清中HIF-1α mRNA表达水平

1～3泳道：对照组；4～6泳道：轻度OSAHS组；7～9泳道：中度OSAHS组；10～12泳道：重度OSAHS组

图3 Western blot检测NF-κB、HIF-1α蛋白表达水平

2.3NF-κB、HIF-1α蛋白表达水平 采用Western blot法检测，与对照组比较，重度OSAHS组NF-κB、HIF-1α蛋白表达水平明显升高(P<0.05)，见图3。

2.4TNF-α、IL-6、SP-A、SP-D水平比较 采用ELISA检测，与对照组比较，中、重度OSAHS组TNF-α升高，重度OSAHS组IL-6升高(P<0.05)。与对照组比较，轻、中、重度OSAHS组SP-A升高，中、重度OSAHS组SP-D升高(P<0.05)。与轻度OSAHS组比较，中、重度OSAHS组SP-A、SP-D升高(P<0.05)。与中度OSAHS组比较，重度OSAHS组SP-D升高(P<0.05)，见表2。

2.5相关性分析 血清SP-A水平与HIF-1α mRNA相对表达水平呈正相关(r=0.197，P<0.05)。其余TNF-α、IL-6、SP-D水平与HIF-1α mRNA及NF-κB mRNA相对表达水平的相关性分析差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。

图4 血清SP-A水平与HIF-1α mRNA表达水平相关性

3 讨 论

OSAHS被认为是一个复杂的、多因素和基因疾病,主要的病理生理机制是睡眠时反复发生的上呼吸道塌陷阻塞，导致慢性间断性低氧。重复性缺氧和再氧化引起线粒体和内质网功能障碍，过度活化的NADPH氧化酶、黄嘌呤氧化酶和解偶联一氧化氮合酶，诱导前氧化物与抗氧化剂之间的不平衡，引起氧化应激和炎性反应增强，导致局部和全身炎症[9-10]。本研究发现，重度OSAHS患者血清HIF-1α mRNA、NF-κB mRNA水平及蛋白质水平均高于对照组，血清TNF-α、IL-6水平也随之增加。考虑与OSAHS患者体内间断低氧，激活HIF-1α及NF-κB等相关的炎症通路，导致下游炎症介质和细胞因子表达增加有关[11-13]。

血清肺表面活性蛋白SP-A、SP-D的水平可作为多种疾病潜在生物标志物，包括间质性肺纤维化(IPF)、慢性阻塞性肺疾病、肺气肿和睡眠呼吸暂停，能有效反映肺损伤程度[14-18]。本研究发现，重度OSAHS患者血清中SP-A、SP-D水平均升高。其机制可能与OSAHS患者夜间间断缺氧及再氧合损伤肺泡屏障、致肺泡部位内皮细胞、Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤，局部血管内皮通透性升高，从而使肺组织SP-A、SP-D渗出到血液中，引起血清中SP-A、SP-D水平增加。同时血清SP-A、SP-D水平与OSAHS严重程度相关。此外，本研究发现血清SP-A水平与HIF-1α mRNA相对表达水平呈正相关。考虑血清中SP-A的表达水平升高，可能与HIF-1α通路激活后，大量炎症因子释放，导致肺泡内皮细胞、Ⅱ型肺泡上皮细胞等损伤有关。

综上所述，OSAHS患者在间歇性低氧下，可能通过激活HIF-1α信号通路，释放NF-κB、TNF-α、IL-6等炎症因子，导致OSAHS患者血清肺表面活性蛋白水平升高，可能参与亚临床肺损伤的发生。