我国西北地区3个广泛种植苜蓿品种的萌发和生长对干旱胁迫的响应

曾泽堂 ，罗永忠 ，柳 佳 ，伏星舟 ，许延昭 ，景全全 ，杨 鹏 ，李 彬 ，慕宗杰

（1.甘肃农业大学林学院，甘肃 兰州 730070；2.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031）

土壤水分是影响植物生理生态特性和生长发育过程的重要因素。随着水资源缺乏和干旱化灾害的不断加剧，植物如何适应干旱已成为世界性的研究课题之一。我国西北地区地处内陆，气候炎热干燥，水分不足是限制当地牧草推广和种植的重要因素。研究植物的抗旱性及抗旱反应机制有助于制定有效的生态抗旱措施，从而更好地应对日益恶化的干旱环境，因此，研究干旱与半干旱条件下植物的萌芽、幼苗生长、内部生理生化反应及植物的抗旱机制是非常必要的。

在抗旱性方面，Steduto等[1]给出了作物反应因子的表达式；Fischer等[2]提出了敏感指数S与旱地产量的关系；兰巨生[3]论证了抗旱指数RI在抗旱鉴定中的实用性；袁志伟等[4]对抗旱性鉴定指标，包括形态指标、萌发和生长指标、生理生化指标等作了综合分析。植株的根、茎、叶等形态器官都可用来估测品种的抗旱能力[5-6]，种子萌发是植物生长的关键阶段，也是进行植物抗旱性研究的重要时期[7]。苏联学者菲尔索娃于1937年提出了种子萌发期的物理吸胀阶段、生化萌动阶段、生物形态学阶段三大阶段。叶常丰[8]从生物学的角度提出：种子实际上是植物生长阶段中最幼嫩的一种状态，它是植物进一步发育为新个体的最关键一环。苜蓿是全世界栽培最广泛的优良豆科牧草，在我国也有大面积种植。PEG-6000，学名为聚乙二醇，是一种大分子聚合物，其亲水性好，能够夺取水分对植物造成渗透胁迫。近年来已经开展了应用PEG-6000模拟干旱对紫花苜蓿及其他植物种子萌发影响的相关研究[9-12]，王玉佳等[13]对干热胁迫对紫花苜蓿叶片生理特性的影响进行了研究，毕淑贻等[14]研究了水分胁迫下紫花苜蓿根系特征与脱落酸（ABA）含量的变化，陈小倩等[15]、刘贵河等[16]对5种豆科牧草种子萌发及抗旱性进行了研究并用模糊数学隶属法做了萌发期抗旱性综合评价，裴帅帅等[17]、郭世华[18]等研究了谷子种子萌发期对水分胁迫的生理响应及其抗旱性。这些研究为植物抗旱性早期鉴定奠定了坚实的理论基础，但总体来看，对于苜蓿方面的研究仍然较少，尤其是我国西北地区广泛种植的苜蓿品种的研究仍较薄弱。

研究甘农一号杂花苜蓿、牧歌紫花苜蓿、新疆大叶紫花苜蓿3个西北地区常用的苜蓿品种在水分胁迫下其种子的萌芽能力、生长能力、幼苗保护酶活性与抗旱性的相关关系，对优良牧草在西北地区的推广种植具有重要的参考价值。因此，该试验采用不同浓度的聚乙二醇在种子萌发期对3个西北地区广泛种植的苜蓿品种种子进行模拟水分胁迫处理，测定不同水分胁迫处理下3个苜蓿品种的种子发芽率、发芽指数、发芽势、活力指数、SOD活性、CAT活性、幼苗叶片含水量等种子萌发期生理生化指标，并分析了3个苜蓿品种在干旱胁迫下的种子萌芽特性、幼苗部分保护酶活性及二者之间的相关关系，比较评价3个苜蓿品种萌发期的抗旱性，旨在进一步认识干旱条件下西北地区广泛种植苜蓿品种的种子萌发适应性和生长状况及其种质选育和推广种植价值，从而为改善西北地区干旱与半干旱地区生态环境、促进农业生态经济发展等方面提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

3个西北地区广泛种植的苜蓿品种：甘农一号杂花苜蓿 （Medicago varia cv.Gannong No.1）、牧歌紫花苜蓿 （Medicago sativa cv.Amerigraze401+Z）、新疆大叶紫花苜蓿 （Medicago sativa cv.Xinjiang Daye）。新疆大叶紫花苜蓿、牧歌紫花苜蓿、甘农一号杂花苜蓿，以下称X、M、G。

1.2 种子萌发和幼苗培养

①仪器清洁：用蒸馏水清洗培养皿（直径9 mm）2～3遍，用滤纸将培养皿吸干后放入98℃烘箱中烘焙24 h。

②种子处理与培养：分别挑选3个苜蓿品种的优质种子，用75%乙醇浸种消毒2 h，用蒸馏水冲洗4～5遍，放至阴暗处自然干燥20 h，然后接种到不同培养皿中培养。培养皿中倒入等体积质量浓度依次为 5%、10%、15%、20%、25%的 PEG-6000溶液 （等同于PEG-6000含量为52.632、111.111、176.471、250.000、333.331 g/kgH2O，各溶液水分渗透势梯度依次为-0.539、-1.767、-3.926、-7.345、-12.489 MPa），用以浸透种子，用电子天平称量培养皿重量并记录。培养皿（直径为90 mm、底铺有2层滤纸），每个处理3次重复，每个重复100粒种子。对各处理下的苜蓿种子进行14 h光照/10 h黑暗（光照强度为7 200 lx），光照期间温度为25℃、黑暗期间温度为20℃[19]，湿度为40%的条件下萌发。由于PEG-6000的不易挥发特性，每天8：00称量培养皿重量计算损失水分，补充损失水分以保持培养皿内PEG-6000溶液浓度不变。种子萌发后，置于光照强度为7 200 lx，湿度为60%的人工智能气候培养箱，15℃（8 h）～25℃（16 h）变温处理。每天观察种子发芽情况，并记录发芽种子数。以有根、芽长等于种子长的1/2为发芽标准，种子开始发芽至第7天，为萌芽期，第7天为发芽结束期。

③幼苗培养：当幼苗长至3～4叶时 （发芽第10天）测定叶片含水量及幼苗超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）。

1.3 种子萌发及幼苗生理生化指标测定

①根据《种子生物学研究指南》计算种子发芽率、发芽势和发芽指数[20]。

发芽率 （GR，%）=（发芽终期全部发芽的种子数/供试种子数）×100%

发芽势 （GP，%）=（前7 d内发芽的种子数/供试种子数）×100%

发芽指数（GI）=∑（Gt/Dt），式中，Gt为 t d 之内的发芽数，Dt为其相应的发芽天数。

活力指数（VI）=发芽指数（GI）×幼苗干重

②生理生化指标的测定：称取0.2 g幼苗本体，加入2 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液（pH值7.8），置于预冷的研钵中研磨成匀浆，10 000×g（4℃）下离心20 min，上清液用作测定SOD、CAT指标的粗酶液制备。SOD活性测定采用氮蓝四唑光化还原法[21]，CAT 活性按照陈军等[22]的方法修改。 叶片含水量[23]=[（叶片鲜重-叶片干重）/叶片鲜重]×100%，随机挑选各处理的3株幼苗，用滤纸吸干幼苗上的附着残留溶液，用电子天平测其叶鲜重，用烘箱将叶烘干后仍用电子天平测其干重。

1.4 抗旱性综合评价方法

采用模糊数学隶属法对3个苜蓿品种种子萌芽期及幼苗生长初期进行抗旱性综合评价[23-24]。

1.5 数据处理

采用Excel 2013统计数据及作图分析，差异性分析采用SPSS 22.0。

2 结果与分析

2.1 不同浓度PEG-6000胁迫对3个苜蓿品种幼苗叶片含水量的影响

由图1可知，随着PEG-6000浓度的增加，除了甘农一号杂花苜蓿在PEG-6000浓度为20%的水分胁迫处理下其幼苗叶片含水量与另外2个苜蓿品种差异显著（P＜0.05），与不同处理间亦差异显著（P＜0.05）外，3个苜蓿品种的叶片含水量总体上差异不显著 （P＞0.05）。说明在PEG-6000胁迫下，3个苜蓿品种萌发期幼苗叶片含水量变化幅度不大，且随着PEG-6000浓度的不断增大其变化趋势亦不定。

图1 不同浓度PEG-6000胁迫对3个苜蓿品种幼苗叶片含水量的影响

2.2 不同浓度PEG-6000胁迫对3个苜蓿品种种子发芽率的影响

3个苜蓿品种种子在培养皿中培养7 d后，统计发芽率。由表1可知，随着PEG-6000浓度的增加，3个苜蓿品种的发芽率都明显下降。胁迫强度最大时，甘农一号杂花苜蓿、牧歌紫花苜蓿、新疆大叶紫花苜蓿相对处理前发芽率分别降低了29.66%、23.67%、23.33%。甘农一号杂花苜蓿和新疆大叶紫花苜蓿在PEG-6000浓度为5%、10%、15%时，处理间差异不显著（P＞0.05），发芽率下降趋势平缓，在PEG-6000浓度为20%与25%2个不同处理间差异显著 （P＜0.05），而牧歌苜蓿在PEG-6000浓度为15%时，发芽率就已经显著下降（P＜0.05）。说明相比于甘农一号杂花苜蓿和新疆大叶紫花苜蓿，牧歌紫花苜蓿的发芽率对水分胁迫更为敏感。随着胁迫进一步加剧，3个苜蓿品种的发芽率皆显著降低。

2.3 不同浓度PEG-6000胁迫对3个苜蓿品种发芽指数与活力指数的影响

由表2可知，随着PEG-6000浓度的升高，3个苜蓿品种的发芽指数均呈明显下降趋势。在PEG-6000为 5%、10%、20%、25%的浓度处理下，3个苜蓿品种的发芽指数种间差异显著（P＜0.05）。 在 PEG-6000为 5%、10%、15%、20%、25%不同浓度的水分胁迫处理下，牧歌紫花苜蓿的发芽指数都显著高于甘农一号杂花苜蓿和新疆大叶紫花苜蓿，且甘农一号杂花苜蓿发芽指数最低。说明水分胁迫对牧歌紫花苜蓿种子萌发的影响总体较小，对甘农一号杂花苜蓿种子萌发影响较大。在5%～25%的PEG-6000浓度处理区间内，3个苜蓿品种的发芽指数下降幅度较大，说明在5%～25%的PEG-6000浓度处理区间内，水分胁迫对3个苜蓿品种种子的萌发具有明显抑制作用；而在5%～15%的PEG-6000浓度处理区间内，3个苜蓿品种的发芽指数下降幅度较小，说明在5%～15%的PEG-6000浓度处理区间内，水分胁迫对3个苜蓿品种的种子萌发影响较小，这可能与种子萌发期的抗旱适应机制有关。

表1 不同浓度PEG-6000胁迫对3个苜蓿品种种子发芽率的影响 %

3个苜蓿品种种子的活力指数随着PEG-6000胁迫的逐渐增强，在5%～25%的PEG-6000浓度处理区间内种间变化显著，总体都呈下降趋势。但甘农一号杂花苜蓿在PEG-6000为15%浓度处理下，活力指数高于PEG-6000为10%浓度处理下的活力指数；在5%～15%PEG-6000浓度处理区间内，活力指数变化幅度较小；在PEG-6000浓度增大至20%及25%时，其活力指数显著下降。牧歌紫花苜蓿在PEG-6000为5%浓度处理下，活力指数显著下降；5%～25%的PEG-6000浓度处理区间内，下降趋势较为平缓。新疆大叶紫花苜蓿在5%～10%、20%～25%的 PEG-6000浓度处理区间内活力指数变化幅度较小；在5%～20%的PEG-6000浓度处理区间内，新疆大叶紫花苜蓿活力指数下降值较大。

2.4 不同浓度PEG-6000胁迫对3个苜蓿品种种子发芽势的影响

由图2可知，随着PEG-6000浓度的逐渐增大，3个苜蓿品种的发芽势都明显下降，在PEG-6000为5%～20%浓度处理区间内，3个苜蓿品种发芽势下降趋势均较平缓，但当PEG-6000浓度增至25%时3个苜蓿品种发芽势则明显下降。尤其是甘农一号杂花苜蓿与新疆大叶紫花苜蓿的发芽势下降幅度较大，说明PEG-6000浓度大于20%时，对甘农一号杂花苜蓿与新疆大叶紫花苜蓿种子萌发造成的影响显著增强。牧歌紫花苜蓿的发芽势随着PEG-6000浓度的增加，下降较为平缓，基本呈平滑曲线结构，且在PEG-6000为25%浓度处理下，牧歌紫花苜蓿的发芽势显著高于甘农一号杂花苜蓿和新疆大叶紫花苜蓿。3个苜蓿品种的发芽势平均值分别为甘农一号杂花苜蓿：79.3%、牧歌紫花苜蓿：83.6%、新疆大叶紫花苜蓿：82.4%，其排序为甘农一号杂花苜蓿＜新疆大叶紫花苜蓿＜牧歌紫花苜蓿，说明在水分胁迫强度较大时，甘农一号杂花苜蓿和新疆大叶紫花苜蓿的发芽势所受影响较大。

图2 不同浓度PEG-6000胁迫对3个苜蓿品种发芽势的影响

表2 不同浓度PEG-6000胁迫对3个苜蓿品种发芽指数与活力指数的影响

图3 不同浓度PEG-6000胁迫对3个苜蓿品种幼苗SOD活性的影响

2.5 不同浓度PEG-6000胁迫对3个苜蓿品种幼苗超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响

由图3可知，随着PEG-6000浓度的增大，甘农一号杂花苜蓿和牧歌紫花苜蓿的SOD活性变化趋势类似，为先减小、再增大、再减小，而新疆大叶紫花苜蓿为先增大再减小。在PEG-6000浓度处理区间为10%～25%内，3个苜蓿品种在PEG-6000为15%浓度处理下，SOD酶活性都达到一个峰值。在PEG-6000为5%浓度处理下，甘农一号杂花苜蓿和牧歌紫花苜蓿均达到最大值，说明二者对早期水分胁迫相对于新疆大叶紫花苜蓿明显更加敏感。新疆大叶紫花苜蓿在PEG-6000为5%的浓度处理下SOD活性最小，在PEG-6000为15%浓度处理下，SOD活性达到峰值且高于甘农一号杂花苜蓿与牧歌紫花苜蓿SOD活性的最大值。在PEG-6000分别为15%、20%、25%的浓度处理下，甘农一号杂花苜蓿的SOD活性值均小于其他两者。随着PEG-6000胁迫的进一步加强，在PEG-6000为25%的浓度处理下，牧歌紫花苜蓿和新疆大叶紫花苜蓿相较于甘农一号杂花苜蓿，持有较高的SOD活性。

2.6 不同浓度PEG-6000胁迫对3个苜蓿品种幼苗过氧化氢酶（CAT）活性的影响

图4 不同浓度PEG-6000胁迫对3个苜蓿品种幼苗CAT活性的影响

由图4可知，3个苜蓿品种的CAT活性随着PEG-6000浓度的逐渐增大，总体趋势都是先增大后减小。甘农一号杂花苜蓿在PEG-6000浓度为10%处理下，CAT活性达到峰值，而牧歌紫花苜蓿和新疆大叶紫花苜蓿在PEG-6000浓度为15%处理下达到各自的峰值，说明甘农一号杂花苜蓿在PEG-6000为10%的浓度处理下、牧歌紫花苜蓿和新疆大叶紫花苜蓿在PEG-6000为15%的浓度处理下，各自的CAT活性对水分胁迫响应最为强烈。在PEG-6000为5%浓度处理下，甘农一号杂花苜蓿和新疆大叶紫花苜蓿相较于牧歌紫花苜蓿，具有较高的CAT活性，说明甘农一号杂花苜蓿和新疆大叶紫花苜蓿的CAT活性对早期轻度水分胁迫就有明显响应。甘农一号杂花苜蓿在PEG-6000浓度增至15%时、牧歌紫花苜蓿和新疆大叶紫花苜蓿在PEG-6000浓度增至20%时，CAT活性极显著下降，说明在干旱胁迫加剧到一定程度时，3个苜蓿品种的CAT活性变化对强度水分胁迫具有显著响应。3个苜蓿品种在PEG-6000为25%浓度处理下，都达到最小值，且牧歌紫花苜蓿＞新疆大叶紫花苜蓿＞甘农一号杂花苜蓿。在干旱胁迫下，3个苜蓿品种的CAT活性对水分胁迫的响应机制基本类似，但又存在具体差异。

2.7 抗旱性综合评价方法

采用模糊数学隶属法进行。采用公式对不同指标的测定值进行标准化处理：

式中，Xij为i种j项指标测定值，Xjmax为3个苜蓿品种的j项指标的最大值，Xjmin为3个苜蓿品种的j项指标的最小值。

表3 主体间效应检验

表4 各指标间的相关性

表5 各指标最大值、最小值、均值及隶属函数值（D）

2.7.1 主体间效应检验（F值）：在该试验中，品种为固定因子，PEG-6000浓度变化为协变量因子，重点考察协变量因子（PEG-6000浓度）对各项指标的影响程度。由表3可知，PEG-6000浓度对发芽率、发芽指数、活力指数、发芽势、SOD活性、CAT活性有显著影响，即在评价萌芽及幼苗初期抗旱性时应着重考量上述指标。

2.7.2 各指标之间相关性：由表4可知，除了叶片含水量，发芽率、发芽指数、活力指数、发芽势、SOD活性、CAT活性两两之间呈显著或极显著正相关。由于抗旱指数与发芽率呈显著正相关[3]，且发芽率与发芽指数、活力指数、发芽势、SOD活性、CAT活性为显著正相关，故用发芽率、发芽指数、活力指数、发芽势及幼苗生长初期的SOD活性、CAT活性6项指标作为3个苜蓿品种萌发期抗旱性综合评价指标。

2.7.3 综合评价：由综合评价均值可以得出，3个苜蓿品种萌发期的抗旱性次序：甘农一号杂花苜蓿＞新疆大叶紫花苜蓿＞牧歌紫花苜蓿，甘农一号杂花苜蓿和新疆紫花大叶苜蓿萌发期抗旱性相差不大，牧歌紫花苜蓿稍弱于前两者（见表5）。

3 结论与讨论

①随着PEG-6000浓度的增加，3个苜蓿品种萌发第10天测得的幼苗叶片含水量基本无显著变化，说明在干旱胁迫下，生长初期的苜蓿幼苗叶片水分含量变化不大，且变化不规律，不宜作为萌发期抗旱性综合评价指标。这与张博文等[25]得出的结论不同，其得出紫花苜蓿萌发初期幼苗叶片含水量随着水分胁迫的增强而减小的结论。高立杰等[26]对紫花苜蓿萌发初期叶片水分饱和亏缺值（WSD）研究表明，叶片WSD对水分胁迫呈规律性变化。在现阶段，国内对于苜蓿苗期叶片含水量的研究较多，但对模拟干旱胁迫下苜蓿萌发初期叶片含水量的研究仍然较少，还有待于进一步深入研究。

②随着PEG-6000浓度的增大，3个苜蓿品种种子发芽率、发芽指数、活力指数、发芽势均呈下降趋势。这与陈小倩等[15]的结论相似：但是陈小倩等人在试验过程中补充的是等浓度PEG-6000溶液，而该试验中补充的是蒸馏水，其种子处理方式与萌发环境选择亦与该试验有差异，从而导致些许偏差。该试验中，当PEG-6000浓度大于20%时，水分胁迫对3个苜蓿品种的发芽率抑制作用极显著，可作为发芽率对水分胁迫响应的一个阈值。该试验在PEG-6000溶液渗透势梯度设计上跨度仍然较大，其具体阈值尚待进一步确认。

③甘农一号杂花苜蓿及牧歌紫花苜蓿随着PEG-6000浓度的增加，其各自的SOD活性趋势变化都是先减小、后增大、再减小，说明甘农一号杂花苜蓿与牧歌紫花苜蓿在干旱胁迫下的SOD活性响应机制是类似的。而新疆大叶紫花苜蓿SOD活性趋势是先增大再减小，不同于其他2个品种，其SOD活性对干旱的响应机制不同。CAT活性变化，3个苜蓿品种均为先增大后减小的变化趋势，虽然峰值出现的环境不同，但趋势一致。总的来说，不同苜蓿品种的CAT活性对干旱胁迫的响应机制总体相同，具体又存在少许差异。SOD、CAT是植物体内重要的保护酶，而将萌发期SOD活性、CAT活性指标纳入苜蓿萌发期抗旱性综合评价指标的研究尚较少。

④由综合抗旱性评价得出，3个苜蓿品种的抗旱性差异不大，甘农一号杂花苜蓿萌发期抗旱性最强，新疆大叶紫花苜蓿萌发期抗旱性稍弱，牧歌紫花苜蓿萌发期抗旱性最弱。萌发期抗旱性综合指标选择原则应避免单一，应兼顾萌芽指标、形态生长指标、生化指标等各方面指标。如陈小倩等[15]只选择了发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数等萌芽指标作为紫花苜蓿抗旱性综合评价指标，高立杰[26]等只选择了部分萌芽指标与1个生化指标和1个形态生长指标作为紫花苜蓿抗旱性综合评价指标，评价指标不够厚实与充足，可能导致抗旱性综合评价结果偏离与不准确。抗旱性综合评价指标应系统区分萌芽指标、形态生长指标、生化指标在苜蓿萌发期抗旱性综合评价中的可靠权重分配。