炎症性肠病相关结肠癌组织差异表达基因的筛选及验证

徐晓晶， 余一祎， 王志明， 崔越宏， 侯英勇， 刘天舒*

1. 复旦大学附属中山医院肿瘤内科，上海 200032 2. 复旦大学附属中山医院病理科，上海 200032

癌症的形成是一个多因素、多步骤过程，慢性炎症作为其中一个重要环节参与了10%～20%的癌症发生，并与治疗反应密切相关[1]。研究[2]证明，炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是某些结直肠癌发生发展的危险因素，包括溃疡性结肠炎和克隆恩病。肠道炎症引起致癌突变进而导致肠癌的发生。随着对恶性肿瘤炎症和免疫微环境认识的进展，IBD相关肠癌的基因组学特点及微生态菌群失调成为了目前研究的热点。

IBD所致肠道炎症的特点是中性粒细胞、巨噬细胞和其他免疫细胞特异性聚集，并释放各种细胞因子、自由基和蛋白水解酶等，从而建立一个肿瘤形成所需的微环境[3]。研究[4]发现，IBD中细胞因子和生长因子的表达谱与结直肠癌有相似之处，包括肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-1(IL-1)、IL-6、IL-17、IL-22、IL-23等。IBD的另一个特点是肠道菌群失调，如具核梭杆菌在结肠癌组织中富集并发挥重要作用[5]。但目前针对IBD相关肠癌发生的具体分子机制尚不清楚。

目前从炎症到肿瘤的基础和转化研究主要利用动物模型[6]，而缺乏人群长期随访结果。因此，本研究采用3组IBD相关结肠癌患者的肿瘤组织和癌周组织进行二代测序，旨在探索炎症相关性肠癌的基因组学特点，寻找并验证差异表达基因，并对其富集的生物学功能进行分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2016年1月至6月就诊我科因炎症性肠病长期随访发现恶性结肠癌者3例，其中1例合并溃疡性结肠炎，2例合并克隆恩病。男性2例，女性1例，中位年龄44岁。2例临床分期为ⅡA期，1例为ⅢB期。3例患者均符合以下条件：(1)按WHO组织学分类标准，经病理学确诊为结肠腺癌合并克隆恩病或溃疡性结肠炎；(2)于2016年1月至6月行手术切除，具体时间分别为2016年2月16日、6月1日、6月15日；(3)手术标本行甲醛固定、石蜡包埋，室温条件下保存，为尽量减少基因降解和损伤，标本均于半年内进行二代测序；(4)手术前未接受过放化疗；(5)既往接受过氨基水杨酸制剂药物治疗，术前半年未接受激素或免疫抑制剂治疗。

1.2 新一代测序及分析 取石蜡块内部组织，使用切片机切割成5～20 μm切片，总量相当于80 μm。采用Ambion○RRecoverAllTM总核酸提取试剂盒提取RNA。用DNaseⅠ去除基因组DNA的污染，用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA；加入打断试剂在Thermomixer中适温将mRNA打断成短片段，以打断后的mRNA为模板合成一链cDNA，然后配制二链合成反应体系合成二链，并使用试剂盒纯化回收、黏性末端修复、cDNA的3′末端加上碱基“A”并连接接头，经片段大小选择后进行PCP扩增。构建好的文库用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System质检，合格后使用Illumina HiSeq 2000平台进行测序。过滤掉低质量、接头污染以及未知碱基N含量过高的数据，然后使用Bowtie2软件和RSEM软件计算基因表达水平。分析不同样品间的差异表达基因，并根据KEGG注释结果及官方分类，将差异基因进行功能分类和生物学通路富集分析。

1.3 建立炎症性肠癌动物模型 采用BALB/c品系雄性小鼠，体质量18～20 g，6～8周龄，第1天腹腔注射氧化偶氮甲烷(AOM)10 mg/kg，予3%右旋葡聚糖硫酸钠(DSS)自由饮用1周，后改为正常饮水2周，如此循环6次。

1.4 RNA抽提及RT-PCR检测 将动物肿瘤组织和癌周组织剪成小块在液氮中磨成粉末，采用TRIzol试剂提取组织内总RNA，测定纯度及浓度。取1 μg RNA反转录成含cDNA的反应体系20 μL，稀释10倍。每次取2 μL。使用SYBR Green进行RT-PCR反应。CST1前引物为：5′-CCG CAC CAT ATG TAC CAA GT-3′，后引物为：5′-CGT AGA TCT CGA AAG AGC ACA A-3′。SFRP4前引物为：5′-CAC AAC GGT GGT GGA TGT AA-3′，后引物为：5′- GTG GAC ACT GGC AAG AAG AA-3′。MSLN前引物为：5′-GTC AAC AAA GGG CAC GAA ATG-3′，后引物为：5′- AGG GTG TCT AGG GTG TCT TT-3′。TRIM29前引物为：5′-GGA GAC CAC CCA GAA GAA TTT-3′，后引物为：5′- GGC AGG TCA TT GTC AGA GTT-3′。CCL11前引物为：5′- TTC AGC GAC TAG AGA GCT ACA-3′，后引物为：5′- GAA TCC TGC ACC CAC TTC TT-3′。LTF前引物为：5′-GTG GTG TCT CGG ATG GAT AAG-3′，后引物为：5′- GGG CAG TCA GAT CCA TTT CT-3′。β-actin前引物为：5′-CGT GGG CCG CCC TAG GCA CCA-3′，后引物为：5′-TTG GCT TAG GGT TCA GGG GGG-3′。PCR扩增程序：95℃预变性10 min，95℃变性10 s，60℃退火及延伸20 s，循环数为45个。用RT-PCR仪自带软件分析，获得扩增产物的Ct值，结果采用2-ΔΔCt法来分析mRNA的相对表达量。

1.5 统计学处理 采用SPSS 12.0软件，比较样本间的基因表达量采用平均值的差异倍数(fold change)，倍数≥2倍且检验水准(α)为0.05。在富集分析时，对P值进行误判率(FDR)校正，通常FDR≤0.01者视为显著富集。FDR是错误发现率的简称，用于控制多重试验中的Ⅰ型错误率。

2 结 果

2.1 采用FFPE标本进行测序的可靠性 各个样本中质量值大于20的碱基数目占总碱基数目的比例(Q20)均大于99%，碱基含量分布以及质量分布均符合统计分析的要求。与参考基因组序列进行比对后，每个样品的比对率均在80%左右，同时样品间均匀的比对率表明样品间具有可比性。

2.2 差异表达基因检测 根据各个样品基因表达水平结果，筛选出肿瘤组织和癌周组织间的差异表达基因。结果(表1)显示：在肿瘤组织中的表达显著上调的基因包括CST1、KRT80、SFRP4、MSLN等，显著下调的包括SLC6A19、HGD、CCL11、LTF等。

表1 肿瘤组织/癌周组织前10位的差异表达基因

2.3 采用动物组织验证差异表达基因 建立炎症性肠癌动物模型后选择其中6个基因(CST1、SFRP4、MSLN、TRIM29、CCL11、LTF)在动物组织中进行PCR验证，结果表明除MSLN、CCL11外其他基因的表达趋势与测序结果一致(图1、图2)。

图1 在炎症性肠癌动物组织中验证差异表达基因

A，B：小鼠癌周组织H-E染色，可见正常腺体结构;C，D：AOM/DSS联合诱导小鼠CAC模型标本H-E染色，可见典型恶性表现，如腺体紧密贴合、形成筛孔状、腺泡内可见坏死.Original magnification: ×40 (A,C), ×200(B,D)

图2 PCR验证差异表达基因

2.4 Pathway功能分类和富集分析 KEGG生物通路分类和富集分析显示，IBD相关的肿瘤组织与癌周组织间的差异表达基因共涉及112个通路，其中前10位的通路如表2所示。富集最多的通路集中于免疫性疾病、免疫系统感染性疾病和信号转导等。其中，富集最明显且包含差异表达基因最多的是原发性免疫缺陷相关通路(图3)。

表2 前10位差异表达基因富集的通路 n(%)

图3 Pathway功能富集图

颜色代表Q值(颜色越白值越大，越蓝值越小)，值越小代表富集结果越显著;点的大小代表差异基因数目(点越大代表数目越多，越小代表数目越少)

3 讨 论

IBD是一种自身免疫紊乱导致的肠道慢性非特异性炎症性疾病，是结直肠癌发生发展的重要危险因素。据报道，防治IBD的药物如氨基水杨酸、维生素D等可能降低结直肠癌的发生风险[7-8]。由于缺乏长期随访的大规模前瞻性临床研究，目前关于炎症性肠病所致结直肠癌的研究主要基于动物模型。本研究采用回顾性的研究方式，对甲醛固定石蜡包埋临床样本进行测序。考虑到在制备和储存过程中，FFPE样品的DNA容易发生降解、损伤、分子或生物学修饰，因此本研究仅回顾性分析了半年内经手术切除的常温保存的石蜡标本。结果表明，经数据过滤后，其碱基含量分布以及质量分布均符合统计分析的要求且样品间具有可比性。因此，采用FFPE标本进行测序具备一定的可靠性。研究[9-11]证实，在新鲜组织难以获得的情况下，FFPE标本可以作为备选方案进行新一代测序。

本研究通过对3例炎症性肠病所致结肠癌患者的肿瘤组织和癌周组织进行测序，发现两者间存在上万个差异表达基因，涉及分子、细胞、生物过程等各个方面。进一步分类和富集分析提示，这些差异基因主要与人类免疫缺陷性疾病和感染性疾病相关。其次，信号转导、运输和代谢也起到重要作用。NF-κB、PI3K-Akt、钙离子、B细胞受体、EB病毒感染等传统信号通路也参与其中。本研究进一步总结了差异倍数前10位的基因，根据文献报道挑选了6个基因在炎症性肠癌动物模型的新鲜肿瘤组织和癌周组织中进行了PCR验证。结果提示，除MSLN、CCL11外，其他基因的表达差异趋势与测序结果一致。据报道，分泌型卷曲相关蛋白4(SFRP4)作为Wnt信号通路的调节剂，参与细胞增殖、分化、凋亡及肿瘤形成过程[12]；MSLN编码的间皮素作为细胞黏附蛋白，在多种肿瘤中呈现过表达[13]；人类宿主因子TRIM家族蛋白TRIM29通过抑制先天性免疫反应，从而促进鼻咽癌患者EB病毒持续性感染[14]；肿瘤相关钙离子信号转换因子2(TACSTD2)能够编码肿瘤相关性抗原，是一种参与钙离子信号转换的细胞表面受体[15]。上述基因的表达在IBD相关肿瘤组织中均呈上调趋势。还有一些下调的基因，例如LTF编码的乳酸转铁蛋白作为非特异性免疫系统的重要部分，参与宿主防御微生物感染、调节细胞生长和分化、阻止肿瘤形成和转移[16-17]，其表达下调可能参与炎症及肿瘤的形成。

目前，炎症性肠癌动物模型一般采用致癌剂氧化偶氮甲烷(AOM)/致炎剂葡聚糖硫酸钠(DSS)方法诱导。在炎症至肿瘤的不同阶段留取标本进行基因组学、蛋白质组学的研究简单易行，但并不能准确反映人类炎癌的特征。研究模型成为了限制因素。随着三维培养的发展，利用患者的自身肿瘤细胞，研究其与免疫细胞间的相互作用，并进行药物筛选，能为实现个体化治疗提供基础。今后有待收集新鲜的人类组织标本，进行前瞻性随机对照研究或组织学分析，以验证本研究结论。