Alphastatin多肽联合紫杉醇对裸鼠卵巢癌的治疗作用

尉春艳,弥少茹,常 健,张 熙

(1西安交通大学第二附属医院妇产科,西安 710004;2陕西省澄城县医院妇产科;3西安交通大学第二附属医院神经外科;*通讯作者,E-mail:weichy1023@163.com)

卵巢癌是最常见的女性恶性妇科肿瘤,其治疗方案主要是手术、化疗和放疗。由于卵巢癌发病隐匿,明确诊断时往往已经是晚期,死亡率高,预后差。在这种情况下,化疗对于这一类患者尤为重要。紫杉醇联合铂类的治疗是卵巢癌的一线化疗方案,大部分的卵巢癌患者最初对联合化疗敏感,但大约15%首次诊断为卵巢癌的患者即对此方案无反应,60%以上的复发卵巢癌也表现出对该化疗方案的耐药性[1]。如何提高患者对化疗方案的敏感性对于提高卵巢癌患者的预后十分重要。有研究表明,肿瘤新生血管对于肿瘤的生长十分重要。化疗药物能够导致血管内皮细胞损伤,凋亡,导致新生血管明显减少。但是化疗结束后2-3周血管内皮细胞会缓慢修复,这可能是卵巢癌对化疗耐药的原因之一[2]。因此,抑制血管生成可能能提高卵巢癌的化疗效果。本研究拟用血管抑制多肽alphastatin联合紫杉醇,观察该方案对卵巢癌的治疗效果。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂

人卵巢癌细胞株SKOV3购于中科院上海细胞库。紫杉醇购自江苏奥赛药业,alphastatin多肽序列为ADS GEG DFL AEG GGV RGP RVV ERH,纯度为95%,由上海吉尔生化有限公司合成。鼠抗人血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)购自美国Santacruz公司,AKT和PI3K抗体购自英国Abcam公司。

1.2 细胞培养

用含10%小牛血清的1 640培养基培养人卵巢癌细胞株SKOV3,于37 ℃,5% CO2培养、常规传代,待细胞生长至取对数生长期,0.25%胰蛋白酶进行消化,用PBS制成细胞悬液,调整细胞密度至3×107/ml,为构建动物模型做准备。

1.3 实验动物及动物模型建立

4-6周雌性裸鼠,质量14-17 g,购于西安交通大学动物实验中心。将SKOV3细胞(6×106个/只)接种于裸鼠左侧大腿皮下,2周后取出原代移植瘤,分成0.5 cm×0.5 cm小块,种植于实验用裸鼠左侧大腿皮下。种植2周后选取皮下移植瘤体积150-200 mm3的裸鼠32只,随机分为4组,即对照组,alphastatin组,紫杉醇组,联合治疗组,每组8只。alphastatin组每隔2 d腹腔注射alphastatin多肽1次,每次0.25 mg/kg,一共6次。紫杉醇组尾静脉注射紫杉醇溶液,按20 mg/kg给药,每隔2 d注射1次,共6次。联合治疗组每隔2 d腹腔注射alphastatin多肽同时尾静脉注射紫杉醇溶液,剂量如前。对照组注射等体积的PBS溶液。注射药物30 d处死裸鼠,取出移植瘤,测量移植瘤体积和质量。体积=0.5×长径×短径2。

1.4 计算微血管密度

固定肿瘤组织,石蜡包埋并切片,采用链霉素抗生素-过氧化物酶法(SP法)检测CD34的表达,按照CD34免疫组化试剂盒步骤操作,以细胞质出现棕黄色着色判断为血管内皮细胞阳性。高倍显微镜下随机选择5个视野,计数每个视野下MVD的数目后,然后计算MVD平均数目。

1.5 AKT-PI3K通路的检测

采用Western blot检测VEGF、AKT和PI3K蛋白的表达。提取肿瘤蛋白,并转移至PVDF膜,将PVDF膜加入到封闭液中,37 ℃摇床2 h。将PVDF膜从封闭液中取出,用TBST液清洗,清洗干净后加入一抗,鼠抗人VEGF,AKT和PI3K抗体,4 ℃过夜。将PVDF膜放入37 ℃恒温箱中1 h,加入TBST清洗2次,每次15 min,然后用TBS清洗1次,15 min。加入二抗,室温下孵育2 h,再次加入TBST清洗2次,每次15 min,然后用TBS清洗1次,15 min。封闭后加入二抗,室温下孵育2 h,化学发光显色,以β-actin为内参校正。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 各组裸鼠移植瘤体积、质量和抑瘤率

应用alphastatin或者紫杉醇治疗后,肿瘤的体积和质量显著降低,与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05),联合紫杉醇和alphastatin治疗后,肿瘤的体积和质量明显减少,与对照组、alphastatin组或者紫杉醇组比较,差异均有统计学意义(P<0.01,见表1)。

表1各组肿瘤体积,质量和抑瘤率比较

Table1Comparisonoftumorvolume,weightandinhibitionrateamongfourgroups

组别肿瘤体积(cm3)肿瘤质量(g)抑瘤率对照组1.21±0.282.16±0.47—alphastatin组0.73±0.15*1.36±0.31*37.0%紫杉醇组0.81±0.22*1.83±0.28*33.1%紫杉醇+alphastatin组0.34±0.12*#0.69±0.09*#68.1%

与对照组比较,*P<0.01;与alphastatin组或者紫杉醇组比较,#P<0.01

2.2 各组裸鼠移植瘤中微血管密度

应用alphastatin或者紫杉醇治疗后,微血管密度明显减少(见图1),与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。alphastatin联合紫杉醇治疗后,微血管密度明显减少,与对照组、alphastatin组和紫杉醇组比较,差异具有统计学意义(P<0.05,见表2)。

2.3 各组裸鼠移植瘤中VEGF、AKT和PI3K蛋白的表达水平

紫杉醇或者alphastatin均能抑制VEGF、AKT和PI3K蛋白的表达,但是联合紫杉醇和alphastatin多肽后VEGF、AKT和PI3K蛋白的表达进一步降低,与其他三组分别比较,差异有统计学意义(P<0.05,见图2)。

A.对照组;B.alphastatin组;C.紫杉醇组;D.紫杉醇+alphastatin组图1 不同处理方法后MVD的变化 (×40)Figure 1 Changes of MVD after different treatment (×40)

表2应用alphastatin、紫杉醇以及联用alphastatin和紫杉醇后各组肿瘤的微血管密度

Table2ComparisonofMVDamongfourgroups

组别微血管密度 对照组28.66±5.26 alphastatin组17.53±3.54* 紫杉醇组17.13±3.33* 紫杉醇+alphastatin组19.69±2.24*#

与对照组比较，*P<0.01；与紫衫醇组和alphastatin组比较，#P<0.01

3 讨论

由于卵巢癌呈侵袭性生长,手术难以做到细胞水平的全切,所以术后化疗在卵巢癌的治疗中起着十分重要的作用。目前常用的化疗方案是顺铂加紫杉醇,但是在临床工作中发现,卵巢癌对化疗有抵抗性。卵巢癌的化疗抵抗机制有很多,其中血管生成被认为是重要的耐药机制[3]。有学者认为,化疗药物早期可引起肿瘤血管内皮细胞凋亡,但是化疗结束2-3周后,内皮细胞就会修复。更有学者发现,紫杉醇可活化TLR4/MyD88信号通路,进而活化血管内皮生长因子(VEGF),使血管内皮细胞增殖,导致肿瘤血管生成,促进肿瘤生长,导致化疗失败[4]。目前已有研究证明,抗血管生成药物可提高化疗药物的抗肿瘤作用[5]。但是,目前的抗血管生成药物,包括基因治疗不能特异性作用于肿瘤血管,存在明显的副作用。

与其他三组比较，*P<0.05图2 各组中VEGF、AKT和PI3K蛋白的表达Figure 2 The expression of VEGF,AKT and PI3K protein in ovarian cancer after different treatment

Alphastatin是人纤维蛋白氨基末端24肽,可通过抑制VEGF通路和SIP通路抑制肿瘤内部内皮细胞依赖性血管和血管生成拟态,达到抑制肿瘤生长的目的,并且对正常组织血管无明显作用,因此具有更好的应用前景[6,7]。研究发现,应用紫杉醇化疗结束约2周后可有效抑制肿瘤的生长,而联用alphastatin和紫杉醇后,肿瘤体积明显缩小,与单用紫杉醇或者alphastatin比较均有显著性差异。进一步研究发现,联用alphastatin和紫杉醇组中肿瘤内部微血管密度明显减少。因此,在应用紫杉醇的同时应用alphastatin多肽,可提高卵巢癌的化疗敏感性,达到治疗肿瘤的目的。

研究表明,VEGF/AKT/PI3K信号通路在卵巢癌中呈异常活化状态,在抗细胞凋亡,促进癌细胞增殖方面起着十分重要的作用,是卵巢癌化疗耐药的重要原因[8]。前期研究证明,alphastatin多肽能够抑制VEGF及其下游通路的活性[9],并且鞘氨醇可通过AKT/PI3K通路发挥其生物学作用。本研究发现,单用紫杉醇或者alphastatin后,可明显抑制VEGF、AKT和PI3K蛋白的表达,加用alphastatin多肽后,能够进一步抑制VEGF/AKT/PI3K信号通路的活性,两者具有协同效应。因此,联用alphastatin多肽和紫杉醇化疗,可协同抑制VEGF/AKT/PI3K信号通路,抑制肿瘤内部血管生成,导致化疗增敏,达到更好地治疗卵巢癌的作用。