动物布鲁氏菌病试管凝集试验标准比浊管最大吸光度光谱的研究

（汉台区畜牧兽医技术推广中心，陕西汉中 723000）

布鲁氏菌病（布病）是由布鲁氏杆菌属（Brucella）细菌引起的牛、羊、猪以及人的一种人畜共患病，被世界卫生组织（OIE）列为B类动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。人感染后引发波浪热、关节痛、肌肉痛、睾丸炎、不孕症等病症，长期不愈；家畜感染则引发流产和不育，对畜牧业及人类健康造成极大危害。

国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020年）对各省布病防控要求分别达到控制、净化、消灭标准，检疫、检测、扑杀、无害化处理是非免疫区布病净化的主要手段，检测结果的准确性对净化工作至关重要。我国对动物布病的检测方法有虎红平板凝集试验（RBPT）、试管凝集试验（SAT）、补体结合试验（CFT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和荧光偏振试验（FPA）等。其中RBPT和SAT两种试验是我国目前法定的布病检测方法，经RBPT初筛的阳性样品，SAT确诊在大部分省份，特别是基层检测机构广泛运用。《动物布鲁氏菌病诊断技术》（GB/T 18646-2002）列出的SAT检测结果判定为试验人员肉眼比对判定，受试验人员经验技术、辨色力、外部环境、主观心理因素等影响，判定结果会出现偏差或异议。

通过运用可见光（400～760nm）分光光度法改良SAT试验判定方法对布病监测样品进行预实验，两种判定结果一致，且改良后的判定方法较肉眼判定具有客观性、判定速度显著提高、试验数据可保留等特点。

本试验通过比较试管凝集试验比浊管在405nm、450nm、490nm、630nm四个光谱OD值（吸光度），确定最大吸光度光谱，为进一步开展SAT试验肉眼对法比与分光光度法在判定结果上出现的假阳性、假阴性、可疑样品等指标差异研究奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Model酶标仪（滤光片405nm、450nm、490nm、630nm）；烧杯（0～300ml）；量筒（0～100ml）；布病凝集试管；200～1000µl移液器（大龙200～1000µl、艾本德20～200µl）；分析天平；96孔空白酶标反应板（可拆卸）。

1.2 材料

布病试管凝集抗原，生产厂家：青岛易邦，批号：20150703；苯酚（石炭酸）；0.9%生理盐水。

2 方法

（1）配制稀释液（0.5%的石炭酸生理盐水）。用分析天平称取0.5g石炭酸置于250ml烧杯中，加入100ml0.9%生理盐水，121℃高压灭菌30min。

（2）配制工作浓度（1：20）抗原。用200～1000µl移液器向20ml烧杯中移取0.5ml布病试管凝集抗原、9.5ml0.5%石炭酸，充分混匀。

（3）配制比浊管。严格参照国家标准《动物布鲁氏菌病诊断技术》（GB/T 18646-2002）中标准比浊管的配置方法。用1000～5000µl移液器吸取5ml 20倍稀释抗原液，移至20ml烧杯中，再加入5ml稀释液，配置成10ml（1：40）抗原稀释液，然后将1：40抗原液和0.5%石碳酸生理盐水分别按照1：0、0.75：0.25、0.5：0.5、0.25：0.75、0：1的加样量加入5个比浊管，每管液体总量为1ml，配置完成后37℃环境感作20h。

（4）加样扫描。用20～200µl移液器依次取5个不同浓度的比浊管上层液体200µl，移至空白酶标板，用Model酶标仪配备的405nm、450nm、490nm、630nm四个滤光片进行扫描，读数并记录。

3 结果

3.1 标准比浊管OD值扫描结果

标准比浊管在405nm、450nm、490nm、630nm四个光谱下扫描结果经方差分析，405nm光谱OD值与450nm光谱OD值差异不显著（P＞0.05），与490nm和630nm光谱OD值差异均显著（P＜0.05），450nm光谱OD值与490nm光谱OD值差异不显著（P＞0.05），与630nm光谱OD值差异显著（P＜0.05）。（见表1）。

3.2 标准比浊管OD值直线回归结果

四个光谱OD值均呈现良好的线性关系，其中405nm光谱OD值线性关系最好（R2=0.9992）（见图1）。

表1 标准比浊管OD值扫描结果

图1 标准比浊管OD值线性关系

4 结论

标准比浊管0%、25%、50%、70%、100%五个抗原浓度在405nm光谱下OD值最大，且差异显著（P＜0.05），线性关系最好。确定405nm为标准比浊管最大吸光度光谱值，在下一步研究中，统一用405nm光谱进行试验。