基于ITS2条形码的不同产地重楼遗传序列鉴别特征分析

张晓瑞，张福生，廖登群，孙 鹏，祁建军，李先恩#

(1山西大学中医药现代研究中心,太原 030006;2中国医学科学院药用植物研究所;*通讯作者,E-mail:ample1007@sxu.edu.cn;#共同通讯作者,E-mail:xeli@implad.ac.cn)

重楼是多年生百合科草本药用植物。在《中国药典》收录的重楼品种有七叶一枝花ParispolyphyllaSmith var.chinensis(Franch.)Hara和云南重楼ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz两种,主要用于疔疮痈肿,咽喉肿痛,蛇虫咬伤等疾病的治疗[1]。随着中医药在国内外的影响力不断提高,重楼的药用价值日益受到人们的重视,作为主要原料药材在云南白药、宫血宁、季德胜蛇药等的广泛应用。由于我国适宜重楼生长的地域环境较多,不同重楼品种分布的地区和适应的生长环境也不同[2]。

从遗传、化学成分含量、生态因子等方面对蒙古黄芪等药用植物的道地性研究表明:化学成分含量和生长环境因素与ITS2(Internal Transcribed Spacer)序列的遗传距离相关[3]。有研究表明不同地区生长的重楼其化学成分含量差异较大[4,5]。但不同地区重楼遗传特征的相关研究却未曾报道。因此,本实验拟通过采集不同产地的七叶一枝花和云南重楼,并利用ITS2条形码技术对植物遗传序列快速、稳定的鉴别优势[6],进行样本间序列遗传变异特征的分析,从而进一步在分子水平揭示重楼不同生长地区发生遗传变异的特点,为重楼的栽培选育提供一定的科学依据。

1材料与方法

1.1 仪器与试剂

电子天平(AL204,梅特勒-托利多);台式高速冷冻离心机(3K15型,德国Sigma公司);电泳仪(DYY-7C型,北京市六一仪器厂);基因扩增PCR仪(TC-512,英国TECHNE公司);超微量紫外可见分光光度计(NanoDrop 2000,美国Thermo Fisher公司);冷冻研磨机(SPEX 6870 Freezer/Mill,SPEX SamplePrep公司);凝胶成像分析系统(JY04S-3C,北京君意)。Plant Genomic DNA Kit试剂盒(离心柱型,天根生化科技有限公司);Taq DNA Polymerase(北京欣华绿源科技有限公司);ITS2扩增引物由中国农业科学院作物研究所的农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程开放实验室合成;灭菌ddH2O,其他试剂均为分析纯。

1.2 样本

样本共17份,分别为七叶一枝花Parispolyphyllavar.chinensis和云南重楼Parispolyphyllavar.yunnanensis,采集地点为云南、湖北、福建、四川4个省,由中国中医科学院高慧敏研究员、福建省农科院苏海兰鉴定。样本存放在中国医学科学院药用植物研究所科研楼,信息见表1。

表1重楼实验17份样本信息

Table1Informationof17experimentalsamplesofRhizomaParidis

序号编号样本来源鉴定结果1Y1云南省西双版纳傣族自治州勐海县云南重楼 2Y2云南省大理白族自治州云南重楼 3Y3云南省大理白族自治州弥渡县云南重楼 4Y4云南省大理白族自治州弥渡县云南重楼 5H1湖北省宜昌市五峰土家族自治县七叶一枝花6H2湖北省随州市曾都区七叶一枝花7F1福建省三明市大田县七叶一枝花8F2福建省南平市光泽县七叶一枝花9F4福建省南平市光泽县七叶一枝花10F6福建省南平市光泽县七叶一枝花11F5福建省三明市宁化县云南重楼 12F3福建省宁化县牙梳山保护区七叶一枝花13S1四川省雅安市石棉县云南重楼 14S2四川省乐山市七叶一枝花15S3四川省乐山市七叶一枝花16S4四川省乐山市峨眉山市七叶一枝花17S5四川省乐山市峨眉山市七叶一枝花

1.3 方法

1.3.1 基因组DNA的提取 取适量样品,用75%消毒酒精将样品表面擦拭干净,自然晾干,冷冻研磨机加入液氮充分研磨,每份样品取80-100 mg。用Plant Genomic DNA Kit试剂盒进行DNA提取,提取DNA置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 PCR扩增及产物测序 PCR扩增引物(上游:5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′,下游:5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′)。PCR反应体系为25 μl,包含Taq DNA Polymerase混合液9 μl,上下游引物各1 μl(2.5 μmol/L),样品DNA 1 μl, ddH2O 13 μl。PCR扩增条件:94 ℃变性5 min;94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,共40个循环;72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物样品用1%琼脂糖凝胶电泳检测,经纯化后送至中国农业科学院作物研究所农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程开放实验室进行双向测序。

1.4 数据处理

所测基因序列在GenBank数据库中进行Blast比对验证,在隐马尔可夫模型的HMMer方法[7]基础上,完成各样本的物种鉴定,并将相应序列导入MEGA 4.0进行多重比对及变异位点分析。再通过遗传距离及系统聚类,采用邻接法(neighbor joining,NJ)构建系统进化树(bootstrap=1 000),以显示样品间的进化趋势。

2 结果

2.1 ITS2序列比对结果及遗传变异位点的分析

17份样本的ITS2序列进行Blast比对,除Y1、Y2、S1、Y3、Y4、F5被鉴定为云南重楼外,其余均被鉴定为七叶一枝花。所有得到的序列经Mega 4.0软件处理,能够准确将云南重楼和七叶一枝花有效区分的序列位点共计8处;Y1和S5特有的变异位点,分别有11处和1处。从序列长度看,云南重楼各样本除Y1序列长度是457 bp,其余序列长度均超过636 bp;而七叶一枝花各样本除S5序列长度是663 bp,其余序列长度均为457 bp。上述结果显示两种重楼的不同样本之间序列遗传位点会产生变异,序列长度也不完全相同。

2.2 两种重楼ITS2序列遗传距离

七叶一枝花和云南重楼ITS2遗传距离结果见表2。七叶一枝花和云南重楼二者间的遗传距离是0.025-0.048;七叶一枝花样本之间遗传距离是0-0.004;而云南重楼样本之间的遗传距离是0-0.054。

表2重楼样本之间ITS2序列遗传距离

Table2GeneticdistanceofITS2sequencebetweenRhizomaParidissamples

No1234567891011121314151617120.05430.0310.04540.0340.0480.00250.0330.0470.0010.00460.0330.0470.0010.0040.00070.0310.0450.0000.0020.0010.00180.0540.0000.0450.0480.0470.0470.04590.0330.0470.0010.0040.0000.0000.0010.047100.0330.0470.0010.0040.0000.0000.0010.0470.000110.0310.0450.0000.0020.0010.0010.0000.0450.0010.001120.0340.0480.0020.0020.0040.0040.0020.0480.0040.0040.002130.0270.0320.0230.0260.0250.0250.0230.0320.0250.0250.0230.026140.0270.0320.0230.0260.0250.0250.0230.0320.0250.0250.0230.0260.000150.0330.0470.0010.0040.0000.0000.0010.0470.0000.0000.0010.0040.0250.025160.0270.0320.0230.0260.0250.0250.0230.0320.0250.0250.0230.0260.0000.0000.025170.0330.0470.0010.0040.0000.0000.0010.0470.0000.0000.0010.0040.0250.0250.0000.025

2.3 两种重楼ITS2序列系统聚类分析

利用ITS2序列对17份重楼样本进行聚类分析,邻接法构建进化树,见图1。所有样本明显分成七叶一枝花Parispolyphyllavar.chinensis和云南重楼Parispolyphyllavar.yunnanensis两大支,与鉴定结果一致,其中七叶一枝花中S2和S3亲缘关系较近,F4和F6的亲缘关系较近,H2和S5的亲缘关系近。云南重楼中Y2和S1,Y4和F5亲缘关系较近。

2.4 相对遗传距离区域分布

以两种重楼聚类结果最近的Y1和H2为对照,分别做七叶一枝花和云南重楼样本之间遗传距离的区域分布情况(见图2),七叶一枝花各样本中S2、S3、S4、S5和F2、F4、F6分别聚为一块,样本之间地理位置越接近,其相对遗传距离差异就越小;而H1、H2、F1、F3与其他七叶一枝花的地理位置距离较远,其相对遗传距离差异就越大。云南重楼各样本中Y1、S1和F5地理位置相距较远,其中S1与F5相对遗传距离较为接近,但与Y1的相对遗传距离差异较大;Y2、Y3和Y4地理位置接近,其相对遗传距离无明显差异。

上半部分为七叶一枝花,下半部分为云南重楼图1 邻接法构建ITS2序列系统进化树Figure 1 Construction of ITS2 sequence phylogenetic tree by neighbor-joining method

图形大小与遗传距离成正比图2 七叶一枝花和云南重楼遗传距离区域分布Figure 2 Genetic distance distribution of Paris polyphylla Smith var. chinensis(Franch.) Hara and Paris polyphylla Smith var. yunnanensis(Franch.) Hand.-Mazz

3 讨论

通过重楼样本所得ITS2序列间多重比对及遗传距离、系统进化树的分析阐明了七叶一枝花和云南重楼的ITS2序列之间的亲缘关系和遗传特点。这一结果从物种遗传的角度验证了李恒[2]在重楼属植物研究中通过形态特征及演化趋势形成的分类系统,证明了七叶一枝花和云南重楼是多叶重楼种下的两个变种这一分类方法的合理性。与遗传距离相比,进化树结果能够准确将七叶一枝花和云南重楼有效区分,且能够把同一变种内的不同材料再次区分,遗传距离能够在一定程度上反映样本间的亲缘关系,但系统聚类树呈现的结果更直观。

样本聚类的结果中,云南重楼样本Y1与其他样本能够明显区分,应属于进化过程中较早的一支,其他样本更有可能是由其发展而来。七叶一枝花中各样本聚类结果较为接近,这应该与重楼属植物中ITS2序列相似程度高有关[8]。

从结论看,植物外观形态鉴别和DNA条形码(ITS2)技术都能够鉴别七叶一枝花和云南重楼,但两种方法也有显著不同的特点。从植物形态进行鉴别是最直观快速的方法,而七叶一枝花和云南重楼在形态上非常相似,且要准确鉴别也需从整个重楼属植物的系统分类中进行判断,区别二者需要有丰富的植物鉴别经验,因此具有一定的局限性。应用ITS2鉴定时不受样品外观限制,即可对药材进行准确鉴定[9]的优势,除了能够对完整的植物样本进行鉴定以外,还可以对无法辨识的样品,包括市售的重楼根茎,用于生产繁殖的重楼种子都能够有效鉴定,适合作为标准类鉴定的方法广泛应用。

地理区域分布的相对遗传距离显示:同一种重楼(七叶一枝花或云南重楼)所生长的地理位置越接近,其相对遗传距离就越小,反之则差异越大。这就说明不同环境下所生长的重楼有着不同的进化趋势,可见生长区域(环境)是重楼遗传变异及进化趋势的主要影响因素。但也存在不同地理位置生长的重楼,其相对遗传距离接近的现象,这可能与不同的地理位置却有着类似的气候、土壤、光照、海拔等综合环境因素有关,至于哪种因素的影响程度更大,则需要结合相关的影响因素进一步深入研究,以便为育种栽培等方面提供科学依据。