下调高迁移率族蛋白B1对宫颈癌细胞侵袭、迁移的影响及机制

杨群，李丽

(1四川省人民医院，成都610072；2四川大学华西医院)

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一，在全球范围内妇科恶性肿瘤中发病率位居第二，全球平均每年有53万新发宫颈癌病例，宫颈癌总体病死率达50%，其中发展中国家的宫颈癌病死率超过85%[1]。宫颈癌的复发及转移是影响宫颈癌患者预后的重要原因[2]。高迁移率族蛋白B1(HMGB1)在多种肿瘤中存在过表达，与肿瘤发生及预后相关[3～5]。HMGB1在宫颈癌中也存在过表达，并且与宫颈癌转移和复发等恶性肿瘤表型密切相关，是宫颈鳞状细胞癌早期诊断的预测指标和独立预后因素[6，7]。胞外释放的HMGB1与细胞膜上的Toll样受体4(TLR4)结合，可以激活下游信号传导通路，如磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)、核因子-кB(NF-кB)通路，这将导致基因的过表达以及肿瘤细胞生物学行为的改变。然而，宫颈癌细胞外释放的HMGB1能否与宫颈癌细胞膜上的TLR4结合并激活TLR4/NF-κB和TLR4/PI3K/Akt信号通路，以及对宫颈癌细胞侵袭和迁移能力产生的影响还不清楚。2017年10月～2018年1月，我们观察了下调HMGB1对TLR4/NF-κB和TLR4/PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达的影响，及其对宫颈癌细胞侵袭、迁移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人宫颈癌SiHa细胞购自美国Hyclone生物公司。DMEM高糖培养基(美国Hyclone生物公司)，正丁酸钠(美国Sigma-Aldrich试剂公司)，GAPDH(海基生物科技有限公司)，HMGB1、TLR4等抗体(美国Abcam试剂公司)，兔抗鼠GAPDH单克隆抗体(美国Cell Sigaling Technology试剂公司)，辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG(美国Cell Sigaling Technology公司)，牛血清白蛋白(BSA，美国Sigma生物科技公司)，溴酚蓝(BPB，上海信帆生物科技公司)，Tris-HCl(湖北武汉博士德生物工程公司)，Tris(中国Biosharp生物科技)，SDS-PAGE凝胶试剂盒(湖北武汉拜意尔生物)，BCA蛋白浓度检测试剂盒(美国Thermo公司)，ECL化学发光显色试剂盒(湖北武汉谷歌生物公司)，MTT检测试剂盒(南京凯基生物公司)，Transwell小室模型(BD Biosciences有限公司)，SYBR®Premix Ex TaqTM(日本TaKaRa生物工程公司)。

1.2 细胞培养与分组 将SiHa细胞加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱内孵育，经过3～4次细胞传代，取对数生长期细胞用于实验。将细胞分为对照组和实验组，对照组加入0.01% DMSO、实验组加入HMGB1抑制剂正丁酸钠0.5 mmol/L处理24 h。

1.3 细胞迁移和侵袭能力观察 采用Transwell小室实验。将基质胶加入Transwell小室上室，放入37 ℃、5% CO2培养箱静置成胶；下室中加入含20%胎牛血清的培养基，37 ℃、5% CO2孵箱中培养30 min。将两组细胞加入胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，按1×104/孔加入上室。24 h后以4%多聚甲醛固定15 min，苏木素染色10 min，自来水冲洗，伊红染色2～3 min，蒸馏水冲洗。用手术刀片沿外周切下Transwell膜，置于载玻片上，中性树胶封片。随机选出10个视野在显微镜下观察、拍照，计数每个视野下的完整细胞数，取平均值，实验重复3次。迁移实验步骤同侵袭实验，Transwell小室无需进行铺胶处理，细胞数目为1×105/孔。以穿膜细胞数表示细胞的迁移和侵袭能力。

1.4 HMGB1及TLR4/NF-кB信号通路相关分子[TLR4、NF-кB、整合素av、整合素β3、原肌球蛋白1(TPM1)、丝氨酸蛋白酶抑制剂(maspin)]、TLR4/PI3K/Akt信号通路相关分子(p-PI3K、p-Akt、整合素β1)mRNA表达检测 采用实时荧光定量PCR法。采用TRIzol法提取两组细胞总RNA，逆转录合成cDNA。取PCR产物各10 μL，于EB染色的1.5%琼脂糖凝胶40 V恒压电泳50 min，取出凝胶后在凝胶成像分析系统进行拍照并分析。以2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

1.5 HMGB1及TLR4/NF-κB、TLR4/PI3K/Akt信号通路相关分子蛋白表达检测 采用Western blotting法。取对数生长期细胞，加入胰蛋白酶消化，制成细胞悬液。移入直径10 cm的培养皿中，置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养24 h，使细胞贴壁生长。向培养皿内加入I3C，终浓度分别为0、100、200、300 μmol/L。于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养48 h。弃培养液，PBS洗涤，加入细胞裂解液，提取细胞总蛋白，BCA定量法检测蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶电泳，转PVDF膜；封闭2 h后，加入1∶1 000配置的一抗，4 ℃孵育过夜；洗膜后加入1∶8 000的羊抗兔二抗(过氧化物酶HRP标记)，室温下孵育；洗膜后进行ECL显色，按照ECL显色试剂盒进行操作。以目的蛋白与内参灰度比值表示各蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 两组细胞迁移和侵袭能力比较 对照组迁移和侵袭实验中的穿膜细胞数分别为(80.8±1.8)、(55.2±2.9)个，实验组分别为(62.4±1.1)、(42.2±2.4)个。实验组穿膜细胞数均少于对照组(P均<0.05)。

2.2 两组TLR4/NF-κB和TLR4/PI3K/Akt信号通路相关分子mRNA表达比较 与对照组相比，实验组HMGB1、TLR4、NF-кB p65、整合素av、整合素β3、整合素β1 mRNA表达下降，TPM1、maspin mRNA表达升高(P均<0.05)。见表1。

表1 两组TLR4/NF-κB和TLR4/PI3K/Akt信号通路相关分子mRNA表达比较

注：与对照组相比，*P<0.05。

2.3 两组TLR4/NF-κB和TLR4/PI3K/Akt信号通路相关分子蛋白表达比较 与对照组相比，实验组HMGB1、TLR4、NF-кB p65、整合素av、整合素β3、整合素β1蛋白表达下降，TPM1、maspin蛋白表达升高(P均<0.05)。见表2。

表2 两组TLR4/NF-κB和TLR4/PI3K/Akt信号通路相关分子蛋白表达比较

注：与对照组相比，*P<0.05。

3 讨论

HMGB1可以促进肿瘤细胞侵袭和迁移，影响宫颈癌患者的预后。Li等[8]报道，沉默HMGB1的表达可有效抑制胃癌细胞的侵袭和转移。Chen等[9]采用cDNA微矩阵法检测高侵袭性和低侵袭性的卵巢癌细胞株基因表达的差异，证实HMGB1在卵巢癌高侵袭株中的表达显著高于低侵袭株中的表达，且在敲除HMGB1基因后，有效抑制了细胞的侵袭和迁移。我们的前期研究显示，对于宫颈癌患者，HMGB1的外释放可以促进宫颈癌细胞的侵袭和迁移能力。另外，作为HMGB1的受体，TLR4下游许多信号通路与肿瘤细胞的侵袭和迁移能力相关[10]。

本研究观察了宫颈癌细胞中HMGB1对TLR4/NF-кB信号通路相关分子(TLR4、NF-кB、整合素av、整合素β3、TPM1、maspin)、TLR4/PI3K/Akt信号通路相关分子(p-PI3K、p-Akt、整合素β1)以及宫颈癌细胞侵袭和迁移能力的影响。结果显示，在宫颈癌细胞中，抑制HMGB1的表达可以下调TLR4下游信号通路的表达，从而抑制宫颈癌细胞的侵袭和迁移能力。在宫颈癌细胞中，HMGB1可以通过与TLR4结合，激活TLR4/NF-кB相关的信号传导通路，促进宫颈癌细胞侵袭迁移能力。NF-кB信号通路与肿瘤细胞的侵袭和迁移能力有密切联系。多项实验证明，HMGB1可能通过调控NF-кB信号通路来影响肿瘤的生长[11]。Jube等[12]研究表明，在恶性间皮瘤中，HMGB1可以通过激活NF-кB信号传导通路增加肿瘤的恶性程度和促进转移。有研究报道，HMGB1可以通过激活NF-кB相关的信号传导通路促进肿瘤细胞迁移能力[11]。Eiro等[13]研究证实，TLR4可以通过NF-кB信号通路在结肠癌的发生和发展中发挥重要作用。Liao等[14]研究表明，在转移的乳腺癌细胞中，激活的TLR4可以通过NF-кB信号传导通路促进整合素avβ3介导的乳腺癌细胞的黏附和侵袭性转移。整合素是细胞黏附分子家族的重要成员，主要通过介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质(ECM)之间的相互黏附，并介导细胞与ECM之间的双向信号传导而发挥其作用。整合素αvβ3由av和β3亚单位组成，可以与多种配体结合，表现在多种细胞中，参与到肿瘤的侵袭转移、血管生成、伤口愈合、凝血和炎症等生理以及病理的过程中。整合素对肿瘤血管生成起着重要作用，多种肿瘤表面和新生血管内皮细胞中整合素有较高的表达。在众多的整合素中，整合素αvβ3的作用尤其重要。Liao等[14]研究表明，整合素avβ3是血流中介导肿瘤细胞停滞和侵袭性迁移的过程中的关键整合素。在乳腺癌中，整合素avβ3在侵袭性肿瘤和转移灶中表达上调，故可以用整合素avβ3来描绘转移性表型。整合素avβ3表达水平可能显著影响血流中乳腺癌细胞停滞和转移能力。研究显示，TLR4的配体可能在转移性乳腺癌中通过激活NF-кB信号通路而促进整合素avβ3的表达。研究结果中，使用HMGB1抑制剂的SiHa细胞中，TPM1和maspin表达量降低。肿瘤细胞侵袭性迁移可能受到TPM1和maspin的限制，这两者都可以阻断基质蛋白水解作用来抑制肿瘤细胞的侵袭。在乳腺癌细胞MDA-MB-231中提高TPM1或者maspin的表达可以抑制细胞的侵袭及迁移。研究显示，TLR4信号通路能够调节这些基因以及整合素avβ3的表达，由此来促进转移性乳腺癌细胞侵袭及迁移。TLR4信号通路通过激活NF-кB来降低TPM1和maspin表达。然而这些基因并不是NF-кB直接的靶向基因，因为NF-кB并不会影响这些基因的转录活动。NF-кB事实上是通过上调肿瘤细胞中miR-21的表达来降低TPM1和maspin表达。NF-кB可以被一些致癌基因激活，持续的NF-кB激活可以在大多数乳腺癌细胞中发现。而TLR4信号通路可以进一步增加NF-кB的激活。

本研究显示，在宫颈癌细胞中HMGB1可以通过与TLR4结合，激活TLR4/PI3K/Akt相关的信号传导通路，促进宫颈癌细胞侵袭和迁移能力。PI3K/Akt信号通路与肿瘤细胞的侵袭和迁移能力有密切联系。有研究表明，Akt信号通路在恶性肿瘤的进展中有重要作用[15]。Akt在所有类型的细胞和组织中都有表达。Akt可以提高细胞存活率并成为有效的抗肿瘤靶标。临床上Akt的活性增加可以导致胃癌的进展和细胞增殖，而且Akt也参与到神经胶质细胞的细胞存活和增殖的信号传导通路中。由此可知阻断Akt信号通路可以成为潜在的靶向治疗策略。在肿瘤细胞中，TLR4与配体的结合可以激活下游PI3K/Akt途径，上调IRAK-4表达，促进血管内皮生长因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，导致肿瘤形成[16]。Hsu等[10]的研究显示，在结肠癌细胞中使用LPS激活TLR4信号传导通路可以促进整合素β1介导的结肠癌细胞的黏附和肝转移，用LPS刺激TLR4/MD2复合体可以激活PI3K/Akt信号通路，从而促进下游的整合素β1的功能，由此增加结肠癌细胞的黏附性和转移的能力。包含β1亚单位的整合素主要是介导细胞与细胞外基质成分之间的黏附，故整合素β1表达增加可以促进肿瘤细胞的黏附能力，进一步促进肿瘤细胞的侵袭和迁移。

综上所述，在宫颈癌细胞中，下调HMGB1表达可使TLR4下游信号传导通路分子的表达下调或上调，最终导致SiHa细胞的侵袭和迁移能力下降，说明HMGB1可以通过激活TLR4的两条通路，增强宫颈癌细胞的侵袭和迁移能力。HMGB1以及TLR4/NF-кB、TLR4/PI3K/Akt信号传导通路分子，尤其是其中起着关键作用的HMGB1和TLR4，可以作为未来宫颈癌靶向治疗的研究对象。