道路距离及三种干燥处理对藏羚羊粪样中皮质醇含量影响的研究

李东岭，王深圳，连新明，颜培实*

(1.南京农业大学 动物科技学院，江苏 南京 210095；2.中国科学院西北高原生物研究所 中国科学院高原生物适应与进化重点实验室，青海 西宁 810008；3.青海省动物生态基因组学重点实验室，青海 西宁 810008)

近年来，道路修建和运营对野生动物带来的影响正成为保护生物学的热点[1-3]。研究发现，道路分割了动物栖息地[4]，将动物生活的大面积区域分裂成小区域，造成种群隔离[5-6]；修建和运营过程对于幼小的野生动物(鸟类除外)会直接导致动物的死亡，对于大型野生动物会面临不能顺利通过公路以及及时采食的危险[7]，此外动物警戒时间增加，觅食时间减少[8-9]。因此，如何处理好道路修建与动物保护的关系引起了人们的广泛关注。

皮质醇等糖皮质激素常被用来衡量动物是否处于应激状态[10]。应激状况下通过皮质醇来维持血压稳定以此来维持正常的生理机能。皮质醇水平越高，动物受到环境应激越大。传统的皮质醇测量往往是保定动物采集血液样本进行测量，但是该方法显然不适合大型野生动物的采集，尤其针对国家级保护动物。利用非损伤方法采集动物唾液、尿液和粪便等样品测定的皮质醇含量更能反映出动物正常状态下的应激水平[11-12]。对于野外生活环境下的野生动物，由于野外条件的限定，收集到的新鲜粪样很难及时抽提测定，并且粪样经过干燥，会增大提取率并减少纤维类食物引起含水量增加对激素提取物造成的影响[13]。粪样处理的方法主要有冷冻干燥法和烘箱干燥法两种。烘箱干燥与冷冻干燥相比具有操作简单、耗时短等优点[14]，但干燥的最佳时间需要进一步研究[15]。

本试验收集新鲜的藏羚羊粪便，来研究不同道路距离对藏羚羊应激水平的影响，同时探讨不同干燥处理是否对激素测定产生影响，从而为野生动物栖息地内的道路建设以及当地野生动物保护提供指导与建议。

1 材料与方法

1.1 动物及调查区域

本试验选择区域是可可西里自然保护区的五道梁附近，该区域位于青藏公路的“中段”。可可西里自然保护区位于青藏高原的西北部，该地主要保护藏羚羊、藏原羚、野牦牛等高原珍稀野生动物。试验研究动物为藏羚羊，是国家一级保护动物。选择该区域原因有两点：其一，该地区是三江源自然保护区和可可西里自然保护区的交汇处，每年的六、七月藏羚羊会成群的从越冬地迁往繁殖地，随后八月份带羔羊回迁，该地是其迁移的主要地段也是数量出现较多的地段[16]其二，该区域是青藏公路沿线放牧较少的地区之一，可以减少放牧对动物行为的影响，从而将道路作为外界环境影响的主要因素。

该区域平均海拔约4 600 m左右，气候寒冷，常冬无夏，7月平均气温为5.5 ℃。全年最低气温是1月，为-24.8 ℃[17]。该地植被稀少，空气稀薄，自然环境极其恶劣。

1.2 试验方法

在青藏公路以2 994～3 005 km路段路标作为调查路段，沿着公路行进过程中，看见道路两侧出现藏羚羊群，就停车观察，并记录藏羚羊所在的位置。于2015年8月16～22日进行调查，每次调查时间为9：00～11：00，15：00～17：00。这是因为藏羚羊活动会受时间的影响，为了减少试验误差，每天采样的时间需要大体一致，调查过程中一共采集262份粪样，其中150 m以内有26份；150～300 m有51份；300～450 m有77份；450～600 m有84份；600 m以上有24份。为了减少试验误差，试验过程中，在藏羚羊不受干扰的条件下，待其离开，再收集粪样。将采集的粪样装入保鲜袋中，做好标记，同时用GPS定位，记录距公路的垂直距离，粪样装入车载冰箱中冷冻保存，并及时地运回实验室保存，以备测定。研究表明：样品的新鲜程度会影响激素含量的变化[14]。为了确保试验的准确性，实验采集的是新鲜粪样，其判断标准是粪便的表面是否湿润。

粪便激素的前期处理，参照王慧平等[18]、Khan等[19]、Terio等[20]的方法，并作改进。方法如下：将-20 ℃冷冻保存的粪便样品干燥处理(60 ℃)，烘干时间分别为2 h、4 h、6 h,研磨后称取0.3 g左右的粪样，置于15 mL离心管中，加入90%乙醇10 mL，用涡旋震荡仪轻轻震荡1 min，置于水浴锅中60 ℃水浴20 min。然后以4 000 r/min离心机离心10 min,取出上清液，沉淀中再加入5 mL同上浓度的乙醇，方法同上。将两次上清液合并，水浴蒸干，然后加入1 mL甲醇，漩涡震荡1 min,摇匀分装回收，并放置-20 ℃冰箱中冷冻待测。粪便样品的激素测定：使用上海酶联生物科技有限公司生产的皮质醇试剂盒，测定上述待测样品。测定具体方法如下：(1)室温下平衡20 min后取出所需板条，剩余板条放入4 ℃冰箱并用密封袋密封保存；(2)标准孔分别加入不同浓度的标准品50 μL，加入顺序按照从低到高的顺序加入;样本孔加入待测样本50 μL；空白孔不加待测样本。除空白孔外，标准孔和样本孔分别加入过氧化物酶标记的抗体100 μL，并用封膜板封住反应孔，37 ℃恒温箱温育60 min。(3)弃去废液，用旧纸排干，每孔加入洗涤剂350 μL，静置1 min后，弃去洗涤液，并排干，重复此操作5次。每孔分别加入底物A液和B液50 μL，在37 ℃条件下避光孵育15 min。每孔加入终止液50 μL，在15 min内，用酶标仪在450 nm波长处测定各个孔的OD值。在试验过程中每个样本重复两次，以便减少试验误差。

1.3 数据处理及统计学分析

所有统计分析在IBM SPSS20.0和Excel 2010中进行，使用Kologorov-Smirnov 检验，所有数据符合正态分布。采用单因素方差分别分析三种烘干时间之间的差异显著性；以及不同道路距离的粪样中皮质醇激素含量的差异显著性，试验数据均以“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 干燥时间对皮质醇激素含量的影响

干燥时间分别为2 h、4 h、6 h,试验结果见图1。样品在不同干燥时间下的含水率分别为21%、8%、3%，计算浓度时需换算成绝干样品。试验结果表明，干燥处理4 h与干燥处理2 h和干燥处理6 h相比，差异显著(P<0.05)。这说明干燥时间不同对激素含量是有一定的影响，在使用烘箱干燥法要仔细考虑干燥时间。

图1 干燥时间对藏羚羊粪样中皮质醇激素含量的影响Fig.1 The effect of drying time on the cortisol hormone levels in the Tibetan antelope

2.2 道路距离对皮质醇激素含量的影响

道路距离主要是指藏羚羊到青藏公路的垂直距离。将采集到的粪样按距离分为四个组，分别是0～150 m,150～300 m,300～450 m,450～600 m和600 m以上，试验结果见图2。试验结果表明，道路距离在150 m以内与150 m以外相比，藏羚羊粪样中的皮质醇激素含量，差异显著(P<0.05)。这说明，150 m以内藏羚羊所受的环境应激越大。

图2 道路距离对藏羚羊粪样中皮质醇激素含量的影响Fig.2 The effect of road distance on the cortisol hormone levels in Tibetan antelope

3 讨 论

超低温冷冻干燥法虽然测定结果较为精准[21]，但干燥时间过长，并且对试验仪器要求较高[14]。烘—箱干燥法具有耗时短、操作简单等优点，但是干燥时间和干燥温度不同，可能会导致试验结果的偏差。研究发现，使用烘箱在71 ℃干燥猎豹粪样3 d后测定其皮质醇含量明显降低[22]。本试验将粪样干燥的烘箱温度设为60 ℃，以确保顺利干燥粪样中游离水的同时能够减少皮质醇的降解。通过对比干燥2 h、4 h和6 h 的3个处理时长的结果表明，干燥4 h的粪样中皮质醇的含量最高，且与其他两个处理组差异显著(P<0.05)。这可能是由于粪样干燥2 h时间太少，此时样品的含水率为21%，粪样不易研磨，导致所有粪样无法混匀。这与于小杰等[23]对大熊猫粪团表层和内部的类固醇激素含量的研究结果一致，即粪样中皮质醇激素的分布是不均匀的藏羚羊主要采食禾本科植物[24]，干燥处理4 h后可完全干燥，此时样品的含水率为8%。当干燥6 h后，激素含量会下降。这可能是因为干燥时间过长，部分微生物能在加热期间降解激素[19]。

野生动物皮质醇激素水平受道路距离的影响。道路距离600 m以上的范围受到道路的干扰较小，此时可以认为动物处于正常的生理状态。从图2可知，皮质醇含量在600 m以上距离时，激素含量较低。距离道路150 m内的藏羚羊粪样中的皮质醇含量最高，且与其他距离粪样中的皮质醇含量差异达到显著水平，这说明150 m以内，藏羚羊所承受的环境压力较大。这与李晓晓等[25]的研究结果一致，即道路会让动物表现类似应对捕食风险的行为，距离道路越近，捕食风险越大，藏羚羊表现警戒行为的比例越高。从收集的粪样所做的位置标志可以发现，藏羚羊在不同道路距离出现的频率高低。150～600 m收集到212份粪样而在150 m以内和600 m以上一共收集到50份粪样，这表明藏羚羊在距公路150～600 m范围内出现的频率较高。这与连新明等[8]所发现的藏羚羊平均活动范围距道路580 m相一致。藏羚羊距离公路较近出现的频率较少，这是因为藏羚羊生性胆小，受人类活动干扰会远离道路。同时道路会阻碍动物在道路间的活动，其阻碍能力与动物的运动能力、道路宽度、交通量三个因素有关[26]。野生动物其生理状况和行为活动存在一一对应关系，在未来的野生动物动物研究中，可以测定其生理反应来推测动物的行为活动。

4 结 论

本试验中，干燥处理4 h粪样中皮质醇含量较高。在使用烘箱干燥处理时，要考虑干燥时间对皮质醇含量的影响。此外，道路距离对藏羚羊应激也会产生影响，在以后自然保护区的道路修建中要注意规划，减少对动物应激的影响。