谷胱甘肽、咖啡因、染料木黄酮及其组合对牛冷冻精液精子运动性和体外受精的影响

程 蕾，辛友东，胡修忠，向 敏，刘晓华，王定发，余 婕，周 源，谭明夏，夏 瑜，陶碧菲

(1.武汉市农业科学院 畜牧兽医研究所，湖北 武汉 430208；2.华中农业大学 动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，湖北 武汉 430070 )

精液的冷冻与解冻是家畜育种体外受精技术中常见的操作步骤，但精液的冷冻-解冻以及精子洗涤过程会导致氧化应激，特别是活性氧(reactive oxygen species, ROS)的产生，而ROS可引起多种类型的精子损伤，包括膜脂过氧化、细胞内蛋白渗漏和DNA断裂。因此，冷冻解冻后的精子活力、运动性以及受精潜力通常会降低[1]。谷胱甘肽(glutathione)是精浆和精子细胞中最重要的非酶抗氧化剂，Stradaioli等[2]研究表明，精子在冷冻过程中还原型谷胱甘肽(GSH)的含量会降低，从而导致精子活力和运动能力的显著降低。而在冷冻解冻过程中向精液或精子稀释液中直接加入外源性谷胱甘肽对精子可起到一定的保护作用[3-5]。染料木黄酮(genistein)是一种异黄酮，被认为是精子产生超氧负离子自由基和过氧自由基时的ROS清除剂，也是蛋白酪氨酸激酶的非选择性抑制剂[6]。已有研究证实10 μM genistein可以略微增加人类直线运动的精子活率以及总体活率[7]。咖啡因(caffeine)是一种环核苷酸磷酸二酯酶的非选择性抑制剂，在1971年就被证实对精子活力存在有益作用[8]，之后的研究也表明caffeine能够刺激人类[9]、猪[10]、牛[11]等物种的精子运动性。

虽然已有研究报道了GSH、caffeine和genistein对精液冷冻解冻过程中精子的影响，但目前还没有关于caffeine与GSH或genistein的联合应用对精子运动性以及体外受精能力影响的报道。精子暴露在活性氧环境下会导致受精过程异常，同时也会改变体外胚胎的发育，这引起了学者们的广泛关注。虽然精子运动实验可以评估有关活性氧对精子受精能力的影响，但是这一因素对胚胎发育的影响是不能单独用这些实验来确定。因此，本试验拟通过计算机辅助精子分析(CASA)系统来评估GSH、caffeine和genistein单独和联合应用对牛各种精子参数的影响，并且结合体外受精试验全面评价这三种物质对体外受精后胚胎发育情况的影响，为三种物质在奶牛冷冻精液体外受精以及体外胚胎生产中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 精液制备

将来自5头健康牛的5管(0.25 mL)冻精在37 ℃水浴40s解冻，转入1.5 mL离心管中，300 g离心5 min，去除上层精清，然后加入600 μL的Sp-TALP 或 Fert-TALP 培养基，37 ℃恒温培养箱中孵育20 min。精子上浮结束后，将每等份50 μL(25×106个/mL)的精子悬液转移到1 mL的离心管中，根据试验设计添加不同组合的GSH、caffeine和genistein，本试验包括7个组，分别是(1)对照组(不添加任何物质)；(2)5 mM GSH[2]；(3)5 mM caffeine[9,11]；(4)10 μM genistein[7]；(5)5 mM GSH +5 mM caffeine；(6)10 μM genistein + 5 mM caffeine；(7)5 mM GSH + 10 μM genistein。于37 ℃(Sp-TALP)或38.5 ℃(Fert-TALP)饱和湿度下孵育，定时取样进行精子参数的分析。

1.2 精子运动参数检测

利用CASA系统对精子参数进行评估(SPJ-1系统，徐州圣普)。为了避免误差，所有的实验操作均由一熟练的人员操作。本次试验配套使用了Makler计数池和恒温版，将Sp-TALP 或 Fert-TALP 培养基轻轻地混匀，取10 μL精子悬液放置在Makler计数池中心并盖上盖玻片。每次试验至少取8个不同视野，跟踪和记录200个以上精子。对于公牛精液分析的主要软件设置如下：显微镜放大200倍视野下精子识别大小为2～5 μm，目标大小范围为 25～125 μm2，图像的采集幅数为30帧/秒。精子分析参数包括：总的精子活率(TM，%)，A级(快速前向运动，%) 、B级(慢速前向运动，%)、C级(非前向运动，%)、D级(极慢或不动，%)，直线运动精子活率(PM，%)，平均路径速度(VAP，μm/s)，平均直线速度(VSL，μm/s), 平均曲线速度(VCL，μm/s)，平均侧摆幅度(ALH，μm)，平均鞭打频率(BCF，Hz)，平均移动角度(MAD，°)，前向性(STR，%)，线性度 (LIN，%)和摆动性(WOB，%)。

在前期的初步试验中对精子在Sp-TALP培养基中孵育1 h, 2 h, 3 h, 4 h 和5 h后的精子参数均进行了分析，发现孵化时间的延长对精子运动有负面影响，孵育3 h后直线运动精子活率显著下降(数据未显示)。更重要的是，直线运动精子活率与体外受精率直接相关[17]。基于此，本试验中对Sp-TALP培养基中的精子于37 ℃饱和湿度下孵育2 h后进行CASA分析。

Fert-TALP培养基稀释精子制成悬液，孵育之前将精子获能液(Penicilamine Hypotaurine Epinephrine，PHE)和精子悬液按照1∶3的比例混合，精子获能后其运动性会发生变化，通常情况下在获能液中孵育2～3 h精子会螺旋式前进，而且前进的速度会加快，即发生超活化[18]。在前期的初步试验中对孵育不同时间后的精子参数进行抽样分析，用咖啡因或获能液处理精子并孵育2 h后也观察到了这一现象(数据未显示)。因此，本试验用含有获能液的Fert-TALP培养基处理精子，于38.5 ℃饱和湿度下孵育2 h后进行CASA分析。

1.3 体外胚胎发育

在当地屠宰场采集母牛卵巢放入37 ℃含有1%双抗的运输盐(9 g NaCl溶于1 L双蒸水中，10 mL 100×双抗)中，在1～3 h内运回实验室。用18号针头从卵丘复合体中抽取直径为2～8 mm的卵泡，并在体外培养至成熟。挑选有多层卵丘细胞包围的卵母细胞复合体，用HEPES缓冲液冲洗2次，移入50 μL的受精微滴中，微滴组成：含10%胎牛血清(Gibco)的TCM-199培养基 (Gibco)、 2.5 mM丙酮酸钠、1 μg/mL 17β-雌二醇、0.5 IU/mL促黄体生成素(中科院北京动物所)、0.5 IU/mL卵泡刺激素(中科院北京动物所)、50 ng/mL表皮生长因子(Invitrogen)以及1%青链霉素(Gibco)。38.5 ℃，5%CO2，相对饱和湿度成熟培养24 h。

体外受精过程中精液的制备过程和最开始描述的精液分析类似。在上浮的过程中，用Fert-TALP培养基将精子浓度稀释到4.0×106个/mL。在最终使用的40 μL 微滴中的精子浓度为1×106个/mL，分别在受精滴中添加不同组合的GSH、caffeine和genistein，试验设计同1.1，最后添加精子获能液至微滴总体积到50 μL。于38.5 ℃，5%CO2，相对饱和湿度下进行孵育。精子和卵母细胞经过2 h的共培养，将受精卵转移到含有mSOF介质的胚胎发育微滴中进行体培养。在第3 d(受精当天为0 d)统计胚胎的卵裂率，并用新鲜的mSOF培养基(含5%胎牛血清)换液。在第7 d或8 d统计囊胚率。在胚胎发育的不同时期：卵裂、桑椹胚以囊胚形成期分析谷胱甘肽、染料木黄酮以及咖啡因单独或联合使用对胚胎发育的影响。

1.4 统计分析

所有数据均采用SigmaStat3.5统计软件分析。试验数据用“平均值±标准误(X±SEM)”表示，使用单因素方差分析程序进行数据分析。当方差分析结果表明模型有显著的影响，利用Holm-Sidak多重比较检验确定是否存在显著差异。用 Fisher LSD法进行胚胎发育的数据分析。对于所有的分析，P<0.05则认为是显著的。

2 结果与分析

2.1 对Sp-TALP培养基中精子参数的影响

如表1所示，处理组5 mM GSH+5 mM caffeine的精子活率、VCL和BCF显著高于10 μM genistein+5 mM caffeine处理组(P<0.05)。另外，处理组5 mM GSH + 5 mM caffeine以及10 μMgenistein 的精子运动参数VAP、VSL和BCF均高于对照组，但差异不显著(P>0.05)。

表1 不同组合处理2 h后Sp-TALP培养基中的精子参数Table 1 The effects of different treatment groups on sperm parameters in Sp-TALP medium after 2 h of incubation

注：同行数据肩标有不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。
Notes: Values with different letters within the same row are significantly different(P<0.05).The same below.

2.2 对Fert-TALP培养基中精子参数的影响

精子在PHE混合物中获能后，所有处理组中的精子均发生了超活化，本试验对7种方法处理2 h后的精子进行了精子动力学参数分析(表2)。7种不同的处理方式对精子的总活力没有显著性的影响。与对照组相比，5 mM GSH + 5 mM caffeine处理后直线运动精子活率显著增加(P<0.05)，同时精子运动参数(VCL，BCF和MAD)显著增加(P<0.05)。另外，5 mM GSH + 5 mM caffeine处理后精子运动参数(VAP、VCL以及MAD)显著高于5 mM GSH以及5 mM caffeine处理组(P<0.05)。10 μM genistein处理精子后，直线运动精子活率显著高于对照组(P<0.05)，其他参数例如VAP、VCL、BCF以及WOB高于对照组，但差异不显著(P>0.05)。

表3比较了Sp-TALP培养基和Fert-TALP培养基中精子运动参数的差异情况。结果显示，对照组经PHE混合物处理后精子运动参数PM、VAP、VSL和A级精子比率均显著低于没有经过PHE混合物处理的精子(P<0.05)。然而，对于5 mM GSH + 5 mM caffeine处理组，Fert-TALP培养基中精子VCL显著高于Sp-TALP 培养基(P<0.05)，但运动参数LIN、WOB以及C级精子比率显著低于Sp-TALP 培养基(P<0.05)。此外，10 μM genistein处理组的精子在获能前后的运动参数无显著变化。

表2 不同组合处理2 h后Fert-TALP培养基中的精子参数Table 2 The effects of different treatment groups on sperm parameters in Fert-TALP medium after 2 h of incubation

表3 不同组合处理2 h后Sp-TALP培养基与Fert-TALP培养基中的精子参数比较Table 3 A comparison of the effects of different treatment groups on sperm parameters in Sp-TALP and Fert-TALP medium after 2 h of incubation

2.3 对体外受精后的早期胚胎发育的影响

不同处理组牛卵母细胞胚胎发育的试验结果如表4所示，7种处理组的卵裂率和囊胚率差异不显著(P>0.05)。5 mM GSH + 5 mM caffeine处理组的桑椹胚发育率显著高于5 mM GSH、10 μM genistein + 5 mM caffeine和10 μM genistein + 5 mM GSH处理组(P<0.05)。10 μM genistein处理组的桑椹胚发育率也显著高于5 mM GSH以及10 μM genistein + 5 mM caffeine处理组(P<0.05)。处理组5 mM GSH + 5 mM caffeine以及10 μM genistein与对照组相比，卵裂率与桑椹胚发育率有较大幅度的提高，但差异不显著(P>0.05)。另外，10 μM genistein处理组的囊胚发育率最高。试验结果表明，在牛体外受精介质中添加10 μM genistein或联合使用 5 mM GSH与5 mM caffeine可以轻微促进牛胚胎的体外发育。

3 讨 论

众所周知，精子的冻融和洗涤等过程可能导致精子受到氧化应激而产生不可逆的损伤。而产生这些问题的主要原因是由于存在于精清和精子细胞中的清除过量ROS防止膜脂过度氧化和DNA损伤的内源性抗氧化系统(包括抗氧化分子和酶)的能力受到限制。此外，已有研究表明精浆的抗氧化系统在精子洗涤过程结束后几乎完全丧失[14]，这暗示精子在体外受精的前处理过程中必然会受到ROS的负面影响。

表4 不同组合的处理组对牛IVF的影响Table 4 The effects of different treatment groups on in vitro development following IVF in Fert-TALP medium

目前的相关研究证明，冷冻解冻过程会导致人[3]、牛[15]、猪[4]等物种精子中GSH的含量以及直线运动的精子活率显著减少。在解冻液中添加5 mM外源性谷胱甘肽可以提高人类或公猪精子的总活率和直线运动精子活率[3，16]。相反，本试验在Sp-TALP 或Fert-TALP介质中添加GSH (5 mM)处理精子，与对照组相比精子的总活率和直线运动精子活率并没有增加，本研究中也没有观察到GSH对精子运动性或后续胚胎的体外发育有促进作用。先前的研究与本试验的一个关键区别是悬浮精子细胞的方法不同。本试验中，上浮过程结束后，精子在Sp-TALP 或 Fert-TALP介质中重悬时只存在少量的精浆，使得精子更容易受到ROS的攻击[13]。此外，精子在不同粘度介质中的游动速度显著不同[15，17-18]，在粘弹性介质中精子的游泳速度更快[19]，而在Sp-TALP、Fert-TALP和SOF等水介质中精子鞭毛摆动效率较低。因为在这种情况下，精子移动同样的距离可能需要增加鞭毛和液体之间的摩擦接触时间并消耗更多的ATP。这些变化还可能增加ROS的产生从而间接伤害精子。此外，精子在前进过程中的超活化也会因为鞭毛摆动时“波”的形成与传递的变化而受到影响[20]。基于以上原因，推测本试验中Sp-TALP培养基中精子活力低的现象可能与低粘度的介质有关。

genistein可作为抗氧化剂保护精子免受氧化应激[7，21-22]。在人类精子的研究中所使用的genistein的浓度一般为1 nM～100 μM，也有研究中genistein浓度高达500 μM[23]。尽管genistein对人或老鼠精子的生存能力几乎没有影响，但是它可以通过作为酪氨酸激酶的活性抑制剂来影响人类精子的运动能力[24]。总体而言，不同剂量的genistein对精子存在广泛的作用。Martinez-Soto等[7]研究表明，在解冻液中添加10 μM genistein可以轻微增加精子的活力，减少解冻过程中ROS的产生和防止ROS诱导的DNA损伤，这提示genistein在10 μM浓度下主要以保护人类冷冻-解冻精子免受ROS损伤的方式来发挥作用。最近的研究证实尽管公牛冷冻精液解冻后在培养基中添加10 μM genistein，37 ℃孵育5 h后精子活率与对照组相比没有显著变化；但是genistein处理1 h后的精子与成熟卵母细胞的受精率高于没有使用genistein处理的试验组，而且其显著性受精子浓度的影响[25]。本研究也发现，genistein虽然对Sp-TALP或 Fert-TALP中精子的活率没有显著的影响，但对于维持精子的生存能力是有益的。进一步说，在IVF受精液中添加genistein可以促进胚胎的发育(表4所示)。可能由于体外受精之前使用genistein处理精子后，精浆中的ROS含量比较低，精浆中的抗氧化酶能及时清除多余的ROS，维持精卵融合以及胚胎发育过程中的氧化还原平衡，防止精子遭受氧化损伤和保持正常受精能力，进而保护精子的运动能力并促进胚胎的正常发育。另外，在获能液中添加genistein精子的运动参数没有显著改变，只有少数的获能的精子超活化(数据未显示)。考虑到人类精子获能后发生超活化的比率偏低(4%～12%)[26]，与卵母细胞能够成功受精的牛精子(获能或超活化)比例也可能相对较低。而本试验中精子参数均来自于CASA系统计算出的群体平均值，导致有限的超活化精子数量不能显著影响两种类型介质中的精子参数。

近年来关于精子中第二信使系统的研究表明，caffeine作为一种磷酸二酯酶的非选择性的抑制剂参与调控精子运动性、获能、超活化和受精能力[27]。低剂量caffeine刺激精子可以改善和维持精子活力，而高浓度(>60 mM)则对精子参数有不良影响[8，28]。同时，低剂量caffeine对精子活力影响的研究也存在差异。Garbers等[8]报道指出，在精子稀释液中添加6 mM caffeine，37 ℃孵育4 h后精子活力与对照组相比仍保持在较高的水平(55.2%/27.2%)。而Pereira等[29]在解冻后的牛精液中添加5 mM caffeine，在1～15 min的保存期间，未能提高牛活精子百分率和顶体反应精子的百分率。最后，尽管caffeine可以促进精子获能、顶体反应和过度活化，但是其中任何一个变化都可能会缩短精子寿命，损害授精能力。Momozawa等[30]的研究表明当caffeine浓度为0.02～0.35 mM时并不影响受精率，然而在受精介质中用5 mM caffeine处理精子会降低其活力和受精率。本试验在Sp-TALP 或 Fert-TALP介质中用5mM caffeine处理精子未能提高精子活力和促进体外胚胎发育，尤其是在Fert-TALP介质中，精子经caffeine和PHE混合物处理2 h后，VAP 和VCL低于对照组(P>0.05)和5 mM caffeine + 5 mM GSH处理组(P<0.05)，与Momozawa等报道一致。因此，试验结果提示过量的caffeine刺激会使精子的活力下降，也可能如前所述由于粘性较低的介质导致精子参数值较低。

程蕾等[31]将牛细管精液解冻后直接添加5 mM caffeine + 5 mM GSH，可提高精子的运动性和精清中谷胱甘肽过氧化物酶以及谷胱甘肽还原酶的活性。本试验在联合处理中也观察到了精子参数的细微差别，处理组5 mM caffeine + 5 mM GSH 与对照组相比在Fert-TALP 介质中能够显著增加游动优势(VCL)(P<0.05)和活力(BCF、MAD)(P<0.05)。结果提示caffeine和GSH之间对精子活力存在协同作用，正如前人的研究也指出caffeine和GSH通过共同作用于膜位点激活人类精子[32]，因此推测GSH可能会竞争性抑制caffeine与精子膜上的靶点结合，从而有效降低和缓冲caffeine浓度，维持和提高精子活力。这种处理方式在Fert-TALP介质中也显著增加了直线运动精子的比率，而卵裂率与桑椹胚发育率虽有较大幅度的提高，但与对照组相比差异不显著，这与体外研究显示直线运动精子与受精率呈正相关的报道[12，33]不一致。精卵细胞的结合受到多方面的影响，体外成熟的卵母细胞发生异常和透明带硬化，均可能会阻碍获能后精子的渗入[34]，因此需要更高的VCL、BCF和MAD来穿透卵母细胞并成功受精。事实上，一个高质量精子的小亚群就足以获得较高的受精率[35]，比如本试验中5 mM GSH + 10 μM genistein以及10 μM genistein处理组，虽然在获能前后精子的运动参数无显著变化，但其体外受精卵裂率和囊胚率与对照组相近或有较大幅度的提高。

本试验在Sp-TALP和Fert-TALP培养基中添加5 mM GSH + 5 mM caffeine或10 μM genistein，均能在一定程度上提高牛冷冻精液精子的运动性和生存能力；在受精滴中添加这两种处理，卵裂率、桑葚胚发育率或囊胚发育率与对照组相比有较大幅度的提高，但差异不显著。因此，如何利用不同的生物活性物质处理冷冻精子并改进体外受精的关键技术，进而提高受精率和体外胚胎的生产效率，仍需要进一步的研究。

4 结 论

本研究结果表明，10 μM genistein或联合应用5 mM caffeine与5 mM GSH处理冻精，可以改善牛冷冻精子运动性和生存能力，并对体外胚胎的发育有一定促进作用。