不同温度下油菜素内酯对油桐幼苗生长及生理指标的影响

张帆航，李 泽，谭晓风，李文莹，杨超臣，李艳丽

（中南林业科技大学a. 经济林培育与保护教育部重点实验室；b. 经济林培育与利用湖南省协同创新中心，湖南 长沙 410004）

三年桐Vernicia fordii为大戟科Euphorbiaceae油桐属落叶乔木，是我国特有的经济树种，与油茶、核桃和乌桕并称我国四大木本油料树种，已有千年的栽培历史[1-5]。千年桐Vernicia montana 为大戟科Euphorbiaceae油桐属落叶乔木，又名皱桐，木油树，抗病性较强[5]。桐油是制造优质油漆和油墨的基本原料，油桐果实还可开发利用为优良的生物质柴油及其他工业原料。油桐可能成为缓解我国能源短缺问题最有发展前途的生物质能源树种之一[6-9]。油桐是喜温暖湿润怕严寒气候的植物，而近几年频发的极端高温和极端低温气候十分不利于油桐的生长，因此，提高油桐的耐高温性和耐低温性已经成为生产中一个急需解决的问题。

油菜素内酯（BR）又称芸薹素内酯，是一种新型的植物内源激素，研究发现，BR可以激发植物内在潜能，促进植物生长，提高其耐冷性及抗病抗盐能力。研究结果表明，BR能增强植物的抗热性、抗寒性等对环境的抗逆性[10-11]；同时，BR还能促进豌豆细胞的伸长和分裂，促进导管的分化[12]。曹云英等[13]研究表明，高温胁迫下BR能增加水稻幼苗保护酶（SOD、POD）活性，减少MDA的生成。袁凌云等[14]研究表明，通过BR预处理，减轻了低温对番茄幼苗叶片的伤害，减缓MDA的上升趋势，提高可溶性糖的含量。张海丽等[15]研究表明，低浓度的BR促进了水稻细胞的伸长。Chen等[16]研究表明，水分胁迫下，BR能减少高羊茅MDA生成，增加SOD、POD、叶绿素含量，提高高羊茅叶片的相对含水率（RWC），促进高羊茅的光合作用。因此，探究BR是否能提高油桐耐高温性和耐低温性，促进细胞的伸长和分裂，提高抗氧化酶活性，增强叶片光合作用具有重要意义。

目前，关于BR对木本植物生长状况、生理影响等方面的机理研究较少，主要在水稻、甜瓜、黄瓜、番茄、羊草、葡萄、棉花等植物方面[17-22]，而BR对油桐生长状况及生理、光合生理方面的研究还未见报道。本文以油桐属三年桐和千年桐2个油桐物种为实验材料，采用混合基质培养方法，探讨BR处理下不同温度胁迫对2个油桐物种幼苗的生长状况、生理指标和叶片细胞的影响情况，旨在揭示BR对油桐叶片的作用，以期为油桐栽培中缓解因受温度胁迫而造成危害提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验材料为三年桐和千年桐，2个物种均采自湖南湘西永顺县青坪镇国家种质资源保存库，2016年10月采集4年生三年桐和千年桐成熟种子，阴干，于12月下旬沙藏备用。

1.2 试验设计与方法

试验于2017年4—8月在中南林业科技大学校内进行，选取沙藏长势一致的油桐种子播种于装有基质的规格为20 cm×20 cm×18 cm的塑料盆中（基质含有蛭石、珍珠岩、泥炭和黄土，体积比为1∶1∶1∶1），并于8月5日开始，于每日7:00气孔刚打开时，在油桐叶片表面均匀喷洒浓度为0.1 mg/L的BR，当叶尖有水滴滴下时即可，对照组在叶片表面均匀喷洒相同剂量的水，每日1次，持续1周，最后将油桐幼苗转移进人工气候室中，分别设置3种温度：8、28、38 ℃，进行温度胁迫。每个处理各9盆，共计108株苗。试验期间，各处理每2 d浇300 mL水，持续至试验结束。油桐幼苗在温度胁迫3 d后开始测定生理指标（POD、SOD、MDA、可溶性糖、可溶性蛋白、相对含水率、叶绿素含量）、生长指标等各项指标，并做冰冻切片对叶片细胞进行研究。

1.3 生长指标测定

株高、地径分别用卷尺和游标卡尺测量；地上部分干质量及根系干质量用精确度为0.01的电子天平称量。

1.4 生理指标测定

1.4.1 相对含水率（RWC）的测定

称取新鲜叶片5片，每个处理两份，一份放于培养皿中，注满蒸馏水，盖上盖子，在5 ℃黑暗处放置24 h后称量，得饱和鲜质量，另一份放入烘箱105 ℃杀青15 min后，65 ℃下烘48 h至恒质量，称量得干质量（DW），均用精确度为0.000 1的电子天平称量，计算相对含水率，每个处理重复3次。

1.4.2 叶绿素含量测定

采用丙酮乙醇混合液法，进行叶绿素提取，使用1∶1的丙酮乙醇混合液，在663和645 nm处测OD值，计算叶绿素总量。

临走前，爸妈极力坚持要送我到楼下。我上了出租车，眼泪止不住地流下来，最终在司机师傅的劝慰下嚎啕大哭起来。

1.4.3 SPAD值测定

采用SPAD仪测定。

1.4.4 可溶性蛋白含量测定

采用考马斯亮蓝法，在595 nm处测量OD值，计算可溶性蛋白含量。以BSA为标准蛋白作标准曲线。

1.4.5 可溶性糖含量测定

采用苯酚法，在485 nm处测定OD值，计算可溶性糖含量。以100 µg/L蔗糖标液作标准曲线。

1.4.6 丙二醛（MDA）含量测定

采用硫代巴比妥酸（TBA）法，在450、532、600 nm处测定OD值，计算出MDA浓度。

采用单一提取法，准确称取样品加入预冷的提取液3 mL，冰浴研磨后，转入离心管中，再用2 mL提取液洗研钵，合并提取液并于4 ℃下离心20 min，将上清液分装，分别进行酶活性测定。

1.5 冰冻切片

采用冰冻切片机（Leica CM1950，德国）对新鲜叶片进行切片研究，并用显微镜（OLYMPUS DP73，日本）进行观察并测量叶片厚度和栅栏组织厚度。

1.6 数据处理

用Excel 2013和Origin 9.0对数据进行处理作图，用SPSS 19.0软件进行方差分析（One-way ANOVA和双因素分析）检验其差异显著性。

2 结果与分析

2.1 不同温度下油菜素内酯对油桐幼苗生长的影响

无论是三年桐还是千年桐，在8 ℃和38 ℃处理下，都会受到胁迫，导致2个油桐物种株高和地径生长较28 ℃的变缓，地上干质量和根系干质量都低于28 ℃下的，见表1。由表1可知，三年桐在8 ℃下地上干质量和根系干质量分别比28 ℃降低了25.95%、81.12%，38 ℃下比28 ℃降低了12.66%、18.81%；千年桐在8 ℃下比28 ℃降低了12.23%、62.26%，38 ℃下比28 ℃降低了8.21%、27.09%。同时，BR处理过的油桐相较于CK，株高、地径、地上干质量和根系干质量都有提高，其中，三年桐株高在3种温度下BR处理比CK处理分别提高了32.72%、2.72%、4.05%，地径分别提高了24.32%、30.30%、27.17%，差异显著（P＜0.05），地上干质量分别提高了4.59%、50.21%、36.86%，根系干质量分别提高了12.59%、44.79%、46.33%，差异显著（P＜0.05）；千年桐株高在三种温度下BR处理比CK处理分别提高了2.71%、13.61%、3.24%，地径分别提高23.00%、5.73%、18.78%，地上干质量分别提高了18.44%、37.60%、24.79%，差异显著（P＜0.05），根系干质量分别提高了14.47%、51.55%、59.61%，差异显著（P＜0.05）。

表1 不同温度下油菜素内酯对油桐幼苗生长的影响Table 1 Effects of BR application on the growth of Tung tree seedlings at different temperatures

2.2 不同温度下油菜素内酯对油桐幼苗叶片相对含水率（RWC）的影响

2个油桐物种BR处理的叶片相对含水率高于CK处理的油桐叶片，见图1。由图1可知，在同一温度下，BR处理的三年桐叶片RWC比CK处理的叶片分别高31.31%、10.50%、13.48%；BR处理的千年桐叶片RWC比CK处理的叶片分别高了27.24%、16.73%、12.10%；说明BR能够提升2个油桐物种叶片的相对含水率。同时，由于2个油桐物种在8 ℃和38 ℃下受到胁迫，其RWC较于28 ℃下的2个物种略有降低，其中，三年桐RWC降低幅度大于千年桐，8 ℃下油桐幼苗RWC降低幅度大于38 ℃下的油桐幼苗，说明就RWC而言，低温较于高温对于油桐叶片伤害更大。

2.3 不同温度下油菜素内酯对油桐幼苗叶片叶绿素含量及SPAD值的影响

图1 不同温度下油菜素内酯对油桐幼苗叶片RWC的影响Fig. 1 Effects of BR application on leaf relative water content of Tung tree seedling leaves at different temperatures

无论是三年桐还是千年桐，在3种不同的温度下，BR处理的幼苗叶绿素总量及SPAD值均大于CK处理的油桐幼苗，见图2。由图2可知，同一温度下，三年桐BR处理的叶片叶绿素含量比CK处理高38.89%、6.14%、13.00%，SPAD值比CK处理高26.94%、6.01%、12.77%；千年桐BR处理的叶片叶绿素含量比CK处理高50.03%、2.52%、6.68%，SPAD值比CK处理高33.02%、17.00%、8.13%，说明BR对于油桐幼苗叶片的叶绿素积累具有促进作用。2个油桐物种在28 ℃下，BR处理的幼苗叶片叶绿素总量及SPAD值较于CK处理增加较少，而在8 ℃和38℃下，BR处理的幼苗叶片叶绿素总量及SPAD值较于CK处理增加较多，而且，8 ℃和38 ℃下的2个油桐物种的叶绿素总量和SPAD值均低于28 ℃的2个物种，说明2两个油桐物种在8 ℃和38 ℃下受到胁迫。

图2 不同温度下油菜素内酯对油桐幼苗叶片叶绿素含量及SPAD值的影响Fig. 2 Effects of BR application on chlorophyll content and SPAD value of Tung tree seedling leaves at different temperatures

2.4 不同温度下油菜素内酯对油桐幼苗丙二醛含量（MDA）的影响

相对于28 ℃下的2个油桐物种，8 ℃和38 ℃下的油桐幼苗MDA含量显著提升；而通过BR处理，三种温度下2个油桐物种幼苗相比于CK处理均有下降，8 ℃和38 ℃ 2种温度下降幅度明显，见图3。由图3可知，三年桐下降幅度分别为52.02%、1.67%、20.51%，千年桐下降幅度分别为59.85%、1.40%、30.66%。

图3 不同温度下油菜素内酯对油桐幼苗叶片MDA的影响Fig. 3 Effects of BR application on malondialdehyde content of Tung tree seedling leaves at different temperatures

2.5 不同温度下油菜素内酯对油桐幼苗可溶性糖、可溶性蛋白的影响

与8 ℃和38 ℃的2个油桐物种幼苗相比，28 ℃下的油桐幼苗叶片可溶性糖、可溶性蛋白含量较低，见图4。由图4可知， 8 ℃下的幼苗叶片可溶性糖、可溶性蛋白含量最高，38 ℃下的次之，28 ℃下的最低。对于3种温度下的2个油桐物种，BR处理过的幼苗叶片可溶性糖、可溶性蛋白含量高于CK处理，其中，三年桐可溶性糖提高幅度分别为45.83%、14.79%、14.45%，差异显著（P＜0.05），可溶性蛋白提高幅度分别为3.57%、19.62%、8.16%；千年桐可溶性糖提高幅度分别为67.62%、35.33%、37.09%，差异显著（P＜0.05），可溶性蛋白提高幅度分别为20.88%、16.31%、12.25%。

2.6 不同温度下油菜素内酯对油桐幼苗叶片POD、SOD的影响

图4 不同温度下油菜素内酯对油桐幼苗叶片可溶性糖、可溶性蛋白的影响Fig. 4 Effects of BR application on soluble sugar and soluble protein content of Tung tree seedling leaves at different temperatures

对于三年桐和千年桐2个油桐物种，28 ℃处理下的油桐幼苗POD、SOD活性均显著低于8 ℃和38 ℃处理下的油桐幼苗，见图5。由图5可知，对于同一温度处理下的2个油桐物种的幼苗，BR处理的幼苗叶片内POD、SOD活性高于CK处理的油桐幼苗，其中，BR处理的三年桐幼苗叶片比CK处理的叶片SOD活性分别提高了12.60%、13.59%、4.78%，差异显著（P＜0.05），POD活性分别提高了82.24%、128.58%、89.92%，差异显著（P＜0.05）；BR处理的千年桐幼苗叶片比CK处理的叶片SOD活性分别提高了6.83%、15.78%、4.04%，POD活性分别提高了260.61%、194.04%、101.88%，差异显著（P＜0.05）。

图5 不同温度下油菜素内酯对油桐幼苗叶片POD、SOD的影响Fig.5 Effects of BR application on superoxide dismutase and peroxidase activities of Tung tree seedling leaves at different temperatures

2.7 不同温度下油菜素内酯对油桐幼苗叶片细胞的影响

对于三年桐和千年桐2个物种来说，相对于28 ℃，2个物种在8 ℃和38 ℃条件下，无论栅栏组织厚度还是叶片总厚度，都有大幅度降低，说明2个物种在8 ℃和38 ℃均受到胁迫，见表2。由表2可知，同一温度条件下，2个物种BR处理在栅栏组织厚度和叶片总厚度上均大于CK处理，三年桐在8、28、38 ℃条件下，栅栏组织厚度BR比CK分别大19.70%、16.16%、46.13%，叶片总厚度BR比CK分别大9.21%、13.30%、26.91%；千年桐在8、28、38 ℃条件下，栅栏组织厚度BR比CK分别大93.85%、35.05%、33.01%，叶片总厚度BR比CK分别大56.94%、55.89%、13.21%。说明BR能增加2个物种的叶片的栅栏组织厚度和叶片厚度。

表2 不同温度下油菜素内酯对油桐幼苗叶片细胞影响Table 2 Effects of BR application on cells of Tung tree seedling leaves at different temperatures

3 结论与讨论

高温或者低温环境对油桐幼苗生长有很大的不利影响，而叶片喷施BR对油桐幼苗的生长有利，它能够在温度胁迫条件下提高油桐幼苗的生长量，这与束红梅等[22]在棉花叶片的研究结果相类似。研究表明，BR可以保护生物膜系统稳定，缓解温度逆境所带来的危害[23]，在8 ℃和38 ℃温度下，由于幼苗生长受到抑制，三年桐千年桐2个物种无论是地径还是株高，根上干质量还是根系干质量，CK处理比BR处理都低，这也说明了BR能缓解高温或低温对于油桐幼苗所带来的生长上的危害；其次，对于相同温度条件和相同处理下，三年桐生长量均低于千年桐生长量，这也说明了在温度逆境下，千年桐生长得更好，生长量增加得也更快。研究表明，2个油桐物种幼苗叶片在CK处理和BR处理下叶绿素含量和SPAD值均随着温度的升高呈现先上升后下降的趋势，而相同温度下，BR处理的幼苗叶片叶绿素含量和SPAD值均高于CK处理，这说明在8 ℃和38 ℃下，2个物种受到胁迫，导致叶绿素含量下降，而BR能缓解这种情况，能够在相同温度逆境下，提高叶绿素含量；其次，三年桐在相同温度相同处理下，叶绿素含量均高于千年桐，说明三年桐叶片叶绿素含量较高。

虽然叶绿素含量能在一定程度上反映植物叶片的光合作用和能力，但是，由于其他因素的影响，叶绿素含量并不能十分准确地反映植物叶片的净光合速率，不能很好地从光合生理角度解释BR对于2个物种的油桐幼苗有机物积累及提高其耐热性和耐冷性的作用，而Chen[16]，张永平[17,26]，张睿佳等[15]都有从光合生理的角度分析BR对叶片的作用。由此可见，对外源喷施BR的油桐幼苗进行光合生理方面的研究是十分必要的。

在正常生长条件下，植物体内活性氧的产生和清除处于动态平衡，而逆境会打破这种平衡，增加活性氧的产生，使膜系统损伤，细胞因此受到氧化胁迫，而植物体自身产生的抗氧化酶，如POD、SOD可清除活性氧，所以，POD和SOD含量的高低可以反映植物抗逆性程度[24-25]。张永平等[26]认为，BR能提高甜瓜的耐热性，李杰等[27]认为，BR能提高辣椒的耐寒性，窦巧惠等[28]认为，BR能提高番茄的耐铜能力，本次研究表明，2个物种在8 ℃和38 ℃均受到胁迫的时候，与CK处理相比，BR处理POD和SOD含量均有提升，MDA含量均有降低，说明BR有利于提高POD和SOD酶活性，清除自由基，降低膜脂过氧化产物MDA的生成，从而保护了膜结构和功能，提高了油桐幼苗的耐热性和耐寒性。研究表明，可溶性糖参与渗透调节，并在植物蛋白质稳定方面起到重要作用[29-30]，可溶性蛋白对维持细胞的膨压、抵御或减轻高温伤害具有一定的保护作用[17,30]，本次研究中，同一温度下，2个物种可溶性蛋白、可溶性糖含量和叶片相对含水率BR处理均高于CK处理，说明BR可以促进调节细胞间的渗透，促进维持细胞的膨压，减轻了高温和低温所带来的伤害，这与Chen等的研究相同[16]。

本次研究表明，相比于28 ℃，8 ℃和38 ℃条件下2个物种叶片厚度和栅栏组织厚度大幅度降低，而BR处理高于CK处理，说明BR缓解了高温和低温胁迫下叶片厚度和栅栏组织厚度的降低；同时，在28 ℃条件下，三年桐叶片厚度和栅栏组织厚度2种处理均大于千年桐，但是，在8 ℃和38 ℃条件下，三年桐叶片厚度和栅栏组织厚度两种处理均小于千年桐，说明高温和低温逆境对三年桐叶片厚度和栅栏组织厚度的降低更为明显。

由此可知，用油菜素内酯（BR）处理过的油桐幼苗生长加快，抗逆性显著提高，叶片及叶片栅栏组织加厚，过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、可溶性糖、可溶性蛋白、相对含水率（RWC）均有提升，丙二醛（MDA）含量下降，短时间内提高了叶绿素含量，所以，BR处理下的2个物种的油桐幼苗，耐热性和耐寒性均有提升，BR促进了油桐幼苗的生长，缓解了因温度胁迫而带来的危害。温度胁迫下，2个油桐物种生长量增加均有明显减缓，伴随着株高地径增加减缓的同时，叶片厚度及栅栏组织厚度开始降低。同时，三年桐生长量低于千年桐生长量，三年桐叶片厚度和栅栏组织厚度小于千年桐叶片厚度和栅栏组织厚度，千年桐在低温和高温两个逆境下有机物的增加和生长量的提高优于三年桐。