临床分离肠杆菌科细菌中mcr-1的筛查及其阳性菌株的药敏结果

陆 上， 毕颖敏， 杨 洋， 胡付品， 杨 帆

由于抗菌药物的广泛和不合理使用，细菌耐药问题日益突出。多重耐药革兰阴性菌如碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌（carbapenem-resistantEnterobacteriaceae，CRE）的出现，使现有多数抗菌药物失去效力。与此同时，新型抗菌药物的研发却相对滞后，在此困境下，发现于1947年，后由于肾毒性和神经毒性被临床弃用多年的多黏菌素，凭借其对需氧革兰阴性菌的良好抗菌活性被重新应用于临床，并成为治疗广泛耐药革兰阴性菌感染的重要选择[1-2]。

然而，随着多黏菌素临床应用的增加，不可避免地出现对其耐药的菌株。过去认为多黏菌素耐药都由染色体相关基因的突变引起，如phoP/phoQ，pmrA/pmrB，crrA/crrB等双组份调控系统相关基因的突变或其负反馈调控基因mgrB的灭活等[3]；2015年，中国学者Liu等[4]首次发现质粒携带多黏菌素基因mcr-1，通过编码MCR-1，一种磷酸乙醇胺转移酶，催化磷酸乙醇胺与细菌外膜脂多糖的结合，介导多黏菌素耐药。随后mcr-1基因在意大利、南非、美国等多个国家被报道，见于大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、沙门菌等不同菌属中[5]。质粒介导mcr-1基因的发现，表明多黏菌素耐药基因可在不同菌属中水平传播，提示多黏菌素耐药威胁上升。

为了解国内临床mcr-1基因的流行情况，本研究对临床分离肠杆菌科细菌进行了mcr-1基因的筛查，并对mcr-1阳性菌株进行药敏分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 收集2015—2016年来自全国13个城市不同医院的临床分离肠杆菌科细菌共计1 617株，各医院按统一操作规程将菌株鉴定到种，并记录菌株的相关标本信息，置甘油肉汤管中-80 ℃冰箱保存。剔除同一患者相同部位的重复分离菌株。药敏试验所用质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922，本院抗生素研究所保存菌株。

1.1.2 培养基和抗菌药物 抗菌药物包括多黏菌素E、美罗培南、头孢噻肟等16种抗菌药物，为中国药品生物制品检定所标准品。药敏试验所用阳离子调节肉汤（CAMHB）为美国BD公司产品；LB琼脂，LB肉汤为英国OXOID公司产品；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；rTaq酶、蛋白酶K、Xba I限制性内切酶等相关试剂为日本TaKaRa公司产品；低熔点琼脂糖（Incert）和脉冲场凝胶电泳（PFGE）电泳级琼脂糖（SeaKem Gold Agarose）购自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 药敏试验及结果判定 微量肉汤稀释法测定9株mcr-1阳性菌株对16种抗菌药物的敏感性，操作步骤和结果判读参考2017年版美国临床和实验室标准化协会（CLSI）标准[6]。多黏菌素E药敏结果根据欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）标准进行判读，MIC≤2 mg/L为敏感，MIC＞2 mg/L为耐药[7]；替加环素药敏结果根据美国食品药品监督管理局（FDA）标准判读，MIC≤2 mg/L为敏感，MIC＞8 mg/ L为耐药；头孢哌酮-舒巴坦药敏结果按照CLSI头孢哌酮的折点判读，MIC≤16 mg/L为敏感，MIC≥64 mg/L为耐药[8]；药敏试验数据采用WHONET 5.6软件分析。

1.2.2mcr-1基因检测 煮沸法提取细菌DNA模板，具体步骤参照相关文献[9]；PCR方法检测mcr-1基因，所用引物按文献设计[4]， PCR扩增产物送上海生工生物工程公司测序，测序结果经NCBI网站（www.ncbi.nlm.nih.gov）BLAST程序比对分析证实扩增产物基因的正确性。

1.2.3mcr-1阳性菌株PFGE分析 参照美国CDC PulseNet中用于大肠埃希菌的PFGE标准方法进行操作，选用沙门菌H9812作为标准菌。在细胞悬浮液CSB中加入过夜培养细菌，调整菌液浓度至4.0～4.5麦氏单位，取300 μL至1.5 mL离心管中，再加入适量蛋白K和1% Seakem Gold凝胶，凝固后加入裂解液和蛋白酶K裂解，随后用水和TE buffer重复洗涤。胶块经Xba I进行酶切后电泳、染色成像。图像转换后应用BioNumeric数据库软件处理，选择Dice相关系数和UPGMA 进行聚类分析[10-11]。

2 结果

2.1 肠杆菌科细菌mcr-1阳性菌株检测

1 617株临床分离肠杆菌科细菌，包括肺炎克雷伯菌（682/1 617，42.2%）、大肠埃希菌（625/1 617，38.7%）、肠杆菌属（99/1 617，6.1%，其中阴沟肠杆菌68株，产气肠杆菌31株）、变形杆菌属（96/1 617，5.9%，其中奇异变形杆菌72株、普通变形杆菌24株）、黏质沙雷菌（48/1 617， 3.0%）、枸橼酸杆菌属（34/1 617，2.1%，其中弗氏枸橼酸杆菌33株，布氏枸橼酸杆菌1株）、摩根摩根菌（24/1 617，1.5%）和普罗威登菌（9/1 617， 0.6%）。PCR检测及DNA测序结果显示，1 617株临床分离肠杆菌科细菌中，仅9株（0.6%）细菌mcr-1基因检测呈阳性，9株中1株为肺炎克雷伯菌，8株为大肠埃希菌，其他菌属未检测到mcr-1基因。

2.2 mcr-1阳性菌株对常见抗菌药物的药敏试验结果

药敏结果显示，9株mcr-1阳性菌株对多黏菌素E均耐药，多黏菌素E的MIC为4～8 mg/L；全部菌株对头孢美唑、碳青霉烯类药物及替加环素均敏感；除1株大肠埃希菌外，其余菌株对第三、第四代头孢菌素和氨曲南均耐药。8株大肠埃希菌对哌拉西林-他唑巴坦均敏感； 9株细菌对庆大霉素、环丙沙星和左氧氟沙星均耐药，其中15-W25-21、16-W16-15、16-W16-81同时对阿米卡星耐药，MIC均＞128 mg/L；环丙沙星和左氧氟沙星对9株细菌的MIC分别为＞8 mg/L和＞ 16 mg/L，见表1。

表1 mcr-1阳性菌株对常用抗菌药物的MIC及其临床资料Table 1 The minimum inhibitory concentrations of antimicrobial agents against mcr-1 positive strains and the corresponding clinical data

2.3 mcr-1阳性菌株的标本来源及PFGE分析

9株mcr-1阳性菌株先后于2015年10－12月和2016年5－12月分离获取，标本来源包括血液、痰、引流液和伤口渗出液，见表1；对其中8株mcr-1阳性大肠埃希菌的PFGE分析显示，8株mcr-1阳性大肠埃希菌Xba I酶切PFGE，条带数目在14～20，条带分子量25 kb～600 kb， Dice-UPGMA聚类分析8株细菌分属8个不同型别，未出现同源性高于80%的菌株，见图1。

图1 8株mcr-1阳性大肠埃希菌的标本来源及PFGE聚类分析Figure 1 Pulsed- fi eld gel electrophoresis-based clustering analysis of 8 mcr-1 positive Escherichia coli strains

3 讨论

在过去的数十年间，尽管多黏菌素因肾毒性和神经毒性一度被临床弃用，但是在畜牧业，长期以来各国一直将多黏菌素E用于畜禽的促生长或疾病的预防和治疗，其中，中国更是兽用多黏菌素E的最大生产国，亚洲各国（包括中国在内）在多黏菌素E的全球生产中所占的比例为73.1%，其中28.7%出口至欧洲[12]。2015年， 欧盟和北美分别进口了480吨和700吨来自中国的多黏菌素E[12]。全球范围内多黏菌素E的大量使用，给动物及环境中的细菌造成强大的选择压力，加速了多黏菌素耐药菌株的选择，促进了mcr-1的播散。目前，mcr-1基因已在美国、意大利、丹麦、尼日利亚、英国、法国、德国、突尼斯、加拿大等全球35个国家相继报道，在动物性食品、水、蔬菜、临床分离样本和健康人群体内都有发现，且已扩散到多种肠杆菌科细菌中，如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、沙门菌属等[13]。其中，mcr-1在动物源性菌株中的检测率较高，在临床菌株及健康人类中检测率维持在较低水平，表明mcr-1基因已经广泛存在于环境中并可能通过某种途径由动物传播给人类[5，14]。

质粒介导mcr-1的出现，引发了对于多黏菌素耐药的高度关注和忧虑。本研究筛查了来自全国多个省份和地区共1 617株临床分离肠杆菌科细菌，仅9株（0.6%）细菌mcr-1基因检测呈阳性，其中682株肺炎克雷伯菌中仅1株mcr-1阳性，625株大肠埃希菌中8株（1.3%）mcr-1阳性，其他菌属中并未检测到mcr-1基因，表明临床分离肠杆菌科细菌中mcr-1的检出率仍比较低，推测这可能与前数十年我国临床使用该类药物较少有关。本研究检测出的9株mcr-1阳性菌株多黏菌素MIC值仅4～8 mg/L，其他作者报道多黏菌素对mcr-1阳性菌株的MIC值基本上介于2～16 mg/L，处于较低水平[15-16]，同时，药敏结果显示，8株mcr-1阳性大肠埃希菌中，除菌株16-W57-09外，其他细菌对头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟均高度耐药，但对头孢美唑及哌拉西林-他唑巴坦却均高度敏感，大多数菌株同时也对头孢哌酮-舒巴坦显示敏感，高度提示这7株mcr-1阳性大肠埃希菌为AmpC酶阴性但同时携带有ESBL基因的多重耐药菌株。进一步药敏分析发现，尽管mcr-1阳性菌株对头孢菌素、氨曲南、喹诺酮类药物及庆大霉素敏感性差，但对头孢美唑、碳青霉烯类药物、替加环素均敏感，8株mcr-1阳性大肠埃希菌对哌拉西林-他唑巴坦也大多敏感。因此，质粒携带mcr-1基因介导的多黏菌素耐药相比染色体介导耐药而言，在目前分离临床菌株更为少见，耐药水平相对较低，仍有多种抗菌药物可供选择，目前造成的威胁可能不如后者。

8株mcr-1阳性大肠埃希菌来源于不同的省市，且分属8个不同的PFGE型别，提示其间并无mcr-1阳性菌株的克隆传播。但既往研究表明，mcr-1存在于多种类型的质粒上如IncI2、IncHI2、IncX4等[17]，这些质粒常常携带多种耐药基因如β 内酰胺酶基因（blaCTX-M、blaSHV-2、blaCMY-2等）、磷霉素耐药基因fosA3和喹诺酮耐药基因oqxAB等[18-19]，并可通过结合转移至多种临床常见的宿主细菌如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌等，威胁耐药革兰阴性菌的治疗[4]。因此在我国多黏菌素恢复供应、使用日益增长情况下，携带mcr-1和其他药物耐药基因的质粒可在其选择压力下发生水平传播，导致对β内酰胺类、多黏菌素、磷霉素、氟喹诺酮类等重要抗菌药物多重耐药的威胁亦随之增长，因此，应对mcr-1基因在临床分离菌的检出情况和携带该基因菌株的药敏进行持续监测和密切关注。