高毒力肺炎克雷伯菌诱导人外周血中性粒细胞凋亡延迟及其影响核因子-κB的潜在机制

杜芳玲， 王莲慧， 魏丹丹， 万腊根， 张 伟， 刘 洋

自从20世纪80年代中期，在我国台湾地区社区获得性肝脓肿患者中发现，高毒力肺炎克雷伯菌（hvKP）新型变种已经成为了一种世界性的感染疾病病原体[1-3]。与经典的肺炎克雷伯菌（nonhvKP）感染不同的是，hvKP菌株不仅可以引起免疫力低下患者的医院感染，还可以引起免疫力正常患者社区获得性的严重感染。hvKP菌株的另外一个典型特征是它具备从原始感染部位向身体其他组织器官侵袭的能力，导致远端组织器官的感染，即迁徙性感染的发生[4]，这在革兰阴性杆菌引起的感染中很少见，其具体致病机制至今不 明。

目前已发现，中性粒细胞在hvKP菌株的迁徙性播散中发挥重要作用。以往研究表明诱导中性粒细胞凋亡不仅与细菌的毒力有关，还可能涉及病原体免疫逃逸及宿主体内生存[5]，故了解hvKP诱导中性粒细胞凋亡异常对阐明其致病性有重要意义。核因子-κB（NF-κB）作为一个重要的核因子，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。本研究旨在分析hvKP菌株诱导人外周血中性粒细胞凋亡及对NF-κB的影响。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

hvKP菌株Kp1500分离自临床肝脓肿患者。患者表现出迁徙性播散感染，并参照相关文献[6]对其高黏表型（拉丝试验阳性）和高毒力基因型（K1荚膜血清分型及携带 pLVPK毒力质粒 ）进行了相关确认[7]。肺炎克雷伯菌ATCC 700603（属K6血清荚膜分型）为non-hvKP菌株，作为对照菌株。

1.2 细胞株来源和培养

人中性粒细胞分离自我院健康体检志愿者，采用含10%胎牛血清（FCS）的RPMI1640（GIBCO）培养液在37 ℃，5% CO2条件下培养细胞。

1.3 检测方法

1.3.1 细胞凋亡检测 ①感染患者体内中性粒细胞凋亡检测：抽取hvKP和non-hvKP感染患者外周血3～5 mL，提取外周血中性粒细胞37 ℃条件下分别孵育0、3、6、9 h后检测细胞凋亡情况；②体外诱导中性粒细胞凋亡检测：提取健康体检志愿者外周血中性粒细胞。将hvKP菌株（组）和nonhvKP菌株（组）的新鲜培养物在15 ℃、12 000 r/min离心15 min，沉淀的菌体用无抗生素的2% FCS RPMI1640培养液重悬。按细菌∶细胞=10︰l的比例，将细菌悬液加于单层细胞培养物中，37 ℃条件下分别孵育0、3、6、9 h。凋亡检测为：弃培养液，用pH7.4、0.01 mol/L灭菌PBS洗涤3次后收集细胞，按AnnexinV kit（caltag Laboratories，USA）操作说明书，采用流式细胞仪（Coulter，Epics xL，USA）检测细胞凋亡情况。实验中同时设置不加细菌的正常细胞对照组（0.9 % NaCl 溶液）。早期凋亡细胞可被FITC-Annexin V着色，但不被PI着色，晚期凋亡和坏死细胞可被2种染料同时着色，活细胞不被染料着色，各实验组重复试验3次。

1.3.2 中性粒细胞呼吸爆发的测定 中性粒细胞悬液中加二氢若丹明（dihydrorhodamine，DHR），37 ℃孵育2 min，加菌株刺激10 min，流式细胞仪检测单通道5 000个细胞，激发波长488 nm，发射波长510～550 nm，结果以平均通道荧光强度表示。分别检测对照组、hvKP组及nonhvKP组的第30、95、165 min 上述指标，各实验组重复试验3次。

1.3.3 Westem blot法检测NF-кB p65 按1.3.1中②方法收集hvKP菌和non-hvKP菌并分别感染健康志愿者中性粒细胞 3、6、9 h。用pH7.4、0.01 mol/L灭菌PBS洗涤3次后收集细胞，调整细胞悬液浓度约为106/mL。按蛋白提取试剂盒说明书提取细胞蛋白，蛋白质变性后行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），电泳条件为200 V。电泳完毕后进行转膜，制作滤纸（Whatman，3 MM CHR）-凝胶-膜“三明治”，极恒流300 mA转移70 min，于加样槽中加入相应的一抗（Abcam公司）约1 mL（1∶300），室温下于摇床孵育。用含吐温20的磷酸缓冲盐水（PBST）洗涤10 min，每个加样槽中加入二抗1 mL左右，室温下于摇床孵育1 h。用电化学发光（ECL）进行底物化学发光，ECL试剂用前配制，暗室曝光5～30 s，照相。WB系统可靠性采用内参β-actin进行校正，内参蛋白阳性提示提取的蛋白完整有效。WB检测结果以Gelpro3.2凝胶光密度分析软件处理数据，以平均光密度值（D）/内参β-actin之比计算NF-кB p65蛋白相对表达含量。

1.4 统计学方法

采用SPSS15.0统计学软件，组间均数比较采用t检验，P＜0.0l表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 hvKP与non-hvKP感染患者外周血中性粒细胞的凋亡率

hvKP感染患者外周血中性粒细胞，随着时间延长，凋亡率逐渐升高，在不同时间（0、3、6、9 h）凋亡率均显著低于non-hvKP组和对照组（P＜0.01）。而non-hvKP感染外周血中性粒细胞不同时间（0、3、6、9 h）凋亡率与对照组之间差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

2.2 hvKP和non-hvKP体外诱导外周血中性粒细胞凋亡率

hvKP体外诱导人外周血中性粒细胞后，随着时间延长，凋亡率逐渐升高。hvKP诱导人外周血中性粒细胞不同时间（0、3、6、9 h）凋亡率均显著低于non-hvKP组和对照组（P＜0.01）。而non-hvKP组与对照组之间则差异无统计学意义（P＞ 0.05），见图2。

图1 hvKP和non-hvKP感染患者外周血中性粒细胞凋亡图Figure 1 Apoptosis of neutrophils in patients infected with hypervirulent K. pneumoniae （hvKP） and non-hvKP strains in vitro

图2 hvKP和non-hvKP体外诱导中性粒细胞凋亡图Figure 2 Apoptosis of neutrophils induced by hypervirulent K. pneumoniae （hvKP） and non-hvKP strains in vitro

2.3 外周血中性粒细胞NF-κBp65蛋白含量的变化

与对照组相比，hvKP组和non-hvKP组随着时间延长NF-κB p65蛋白表达逐渐增多，且各个时间点（3、6、9 h）均高于对照组； 而non-hvKP组与对照组之间差异无统计学意义（P＞0.05），见图3。

图3 Western blot检测hvKP和non-hvKP感染外周血中性粒细胞不同时间点时p65蛋白表达变化Figure 3 Western blots for p65 protein expression levels in human neutrophils following hvKP or non-hvKP stimulation

2.4 呼吸爆发功能差异

hvKP体外感染患者外周血中性粒细胞后，各时间点（0、30、95、165 min）中性粒细胞的呼吸爆发强度显著低于non-hvKP组和对照组（P＜0.01）。而non-hvKP组与对照组之间差异无统计学意义（P＞0.05），见图4。

3 讨论

hvKP的临床致病特点及细菌表型特征与传统的医院感染肺炎克雷伯菌存在较大差异[8]，前者感染严重，以多发性脓肿为主要特征，可引起多部位感染（如眼内炎、脑膜炎、肝脓肿等），往往集中于健康青年患者，多为社区获得性感染，但近年也出现医院获得性感染[9-11]。此外，hvKP多表现出高黏性，常携带magA、rmpA及产气菌素等多种毒力基因，往往具备独特的表型和基因型特征[12]。中性粒细胞为机体内最活跃的炎性细胞，在脏器内大量聚集、活化是导致相关炎症性疾病恶化的中心环节。已有研究表明中性粒细胞或在hvKP菌感染中发挥重要作用[5]。激活的中性粒细胞可产生大量自由基、蛋白水解酶及炎性介质等有害物质造成组织损伤。适度清除中性粒细胞是控制炎症发展的重要措施。因此，凋亡作为中性粒细胞重要的非炎性清除方式，在炎症的发生、发展及转归中具有十分重要的作用。但关于hvKP感染时，中性粒细胞的作用及转归，与hvKP菌感染发生发展的关系等，鲜见报道。

图4 hvKP和non-hvKP不同时间点刺激外周血中性粒细胞呼吸爆发强度变化Figure 4 Intracellular reactive oxygen species generation in peripheral neutrophils at different times after hvKP or nonhvKP stimulation

由于中性粒细胞是终末分化细胞，不具备分化、增殖能力，所以当中性粒细胞凋亡受到抑制时，势必导致其生命期限延长。以往研究显示，中性粒细胞凋亡延迟可导致有毒产物释放的机会相对增多，这将加重自身组织细胞损伤。呼吸爆发是中性粒细胞发挥杀菌的重要手段，呼吸爆发功能增强可显著增加中性粒细胞杀菌能力[13]。然而，我们对1株hvKP研究发现，虽然hvKP菌株较non-hvKP在体内外均可显著诱导人外周血中性粒细胞凋亡延迟。然而，我们意外发现，较nonhvKP，hvKP导致人外周血中性粒细胞呼吸爆发能力显著降低，由此我们推测hvKP菌株虽然可以增强凋亡延迟而促进中性粒细胞对hvKP菌株的作用及吞噬，但却可通过抑制其呼吸爆发功能以减少中性粒细胞对hvKP菌株的损伤及杀灭，如此或可促进hvKP菌株在中性粒细胞内的生存，导致hvKP菌更易通过以中性粒细胞为载体在全身进行播散，造成多脏器的迁徙性感染，这与Lin等[5]的研究报道一致。

已有研究表明，NF-κB具有抑制中性粒细胞凋亡的作用[14]。其可能通过中性粒细胞凋亡相关基因的表达调控，延迟中性粒细胞凋亡，从而间接加剧了炎症状态。p65是NF-κB二聚体（p65/p50）主要亚单位之一，代表了NF-κB的激活程度[15]。静息状态时，p65与KB抑制蛋白（IKB）结合，不具有调节基因转录的能力，当细胞受到细胞外信号刺激时，蛋白激酶被激活，IKB磷酸化并降解，从而释放p65，使其得以转位进入细胞核中，诱导靶基因的转录。因此我们推测hvKP诱导中性粒细胞凋亡延迟的作用可能是通过调节NF-κB活性从而抑制中性粒细胞凋亡。本研究结果显示，hvKP感染人外周血中性粒细胞 NF-κB p65蛋白的表达逐渐增多，且NF-κB p65蛋白的表达与中性粒细胞凋亡呈现明显负相关，说明在hvKP感染时，外周血中性粒细胞NF-κB的活化可能与中性粒细胞的凋亡延迟有关。

综上所述，本研究发现hvKP可早期通过活化NF-κB而表现出抑制中性粒细胞凋亡，导致中性粒细胞生命周期延长，从而增强其对hvKP的吞噬及抗感染作用。但意外的是，其却可抑制中性粒细胞呼吸爆发功能而导致中性粒细胞对hvKP杀灭能力下降，如此或可导致hvKP被中性粒细胞吞噬却无法杀灭，最终造成其在全身播散形成迁徙性感染，具体机制有待进一步深入研究。