玉米蛋白磷酸酶2C基因ZmPP2C26两个可变剪接体的功能分析

张盼娃，张夏玮，于好强，盘林秀，付凤玲,李晚忱

(四川农业大学 玉米研究所，四川 成都 611130)

蛋白磷酸酶2C(Protein phosphatase type 2C,PP2C)是蛋白磷酸酶超级家族中的一个家族，它通过对多种信号转导途径中蛋白质可逆磷酸化的调节，在植物生长发育和对环境胁迫的应答中起重要作用[1-2]。拟南芥、水稻等模式植物的PP2C家族成员已经鉴定，并部分验证其功能[3-5]。然而，玉米基因组较大，冗余的重复和转座序列众多，导致基因家族成员间功能的多样性更为复杂[6-8]。迄今为止，只鉴定了ZmPP2C家族中少数成员的功能，比如用ZmPP2C2基因转化烟草可增强其抗寒性[9]，ZmPP2C16在脱落酸(Abscisic acid,ABA)介导的信号转导中起重要作用[10]，以及一个未编号的家族成员转化拟南芥可增强其对非生物逆境的抗性[11]。

本课题组关于ZmPP2C基因在干旱胁迫下的差异表达研究中，克隆了ZmPP2C基因家族的一个成员，并验证其差异表达应答干旱胁迫，当时命名为ZmPP2Ca，在GenBank的注册号为KJ855114.1[12]。值得注意的是，在上述研究中利用不同的PCR体系反复扩增该基因开放阅读框时，均能得到两个长度不同的片段，序列分析表明，两个片段长度相差214 bp，但重叠部分的序列完全相同。因此推测，这两个片段是同一初始转录产物的可变剪接体。根据其推导蛋白与拟南芥和水稻PP2C家族成员的同源性和进化树分析，这一基因在近期的研究中被重新命名为ZmPP2C26[10]。

越来越多的证据表明，50%以上的植物基因均存在可变剪接现象，通过增加转录组和蛋白质组的多样性，应答发育过程和环境胁迫[13-23]。例如，小麦DREB2基因[18]、拟南芥SR和SOS4基因[19-20]、水稻OslM和OsMAPK5基因[21-22]的可变剪接都被证明与非生物逆境胁迫应答有关。在耐旱性极强的复苏草本植物Sporobolusstapfianus中，PP2C基因家族一个成员的可变剪接也被证实对干旱胁迫有应答[23]。

本研究利用反转录PCR扩增玉米ZmPP2C26基因的两个可变剪接体，用以转化野生型拟南芥，结合蛋白的亚细胞定位，验证其在干旱胁迫应答中的功能。

1 材料和方法

1.1 ZmPP2C26不同剪接体的克隆

取玉米模式自交系B73幼苗的叶片，用RNAiso plus kit(TaKaRa,大连)提取总RNA。用RNase-free DNase(TaKaRa,大连)去除可能的基因组DNA污染后，用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis kit(TaKaRa,大连)反转录成cDNA。根据ZmPP2C26基因在GenBank的注册序列(KJ855114.1)，用Primer-BLAST软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)设计特异PCR引物(5′-ATGTCTTGCACGGTGGCCA-3′，5′-GAGCTTGAAAATTTCTGCAACT-3′)，用LATaqDNA Polymerase和GC BufferⅠ(TaKaRa,大连)扩增ZmPP2C26基因的开放阅读框。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离，用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen,德国)回收特异条带，亚克隆至pMD19-T载体(TaKaRa, 大连)，送上海生物工程有限公司测序。利用Spidey软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/spidey/)对测序结果与玉米自交系B73基因组DNA序列(Maize Genetics and Genomics Database，http://www.maizegdb.org/)进行比对，分析ZmPP2C26基因的外显子/内含子结构，用BLASTp软件(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对较长与较短剪接体推导蛋白的氨基酸序列。

1.2 植物表达载体构建和拟南芥的转化

用引入限制性酶切位点SmaⅠ和SalⅠ(下划线碱基)的特异引物(5′-TCCCCCGGGATGTCTTGCACGGTGGCCA-3′,5′-GCGTCGACGAGCTTGAAAATTTCTGCAACT-3′)，从克隆载体pMD19-T上扩增不带终止密码(TAA)的ZmPP2C26基因长(LV)、短(SV)两个可变剪接体的开放阅读框。扩增产物经限制性内切酶SmaⅠ/SalⅠ双酶切消化后，插入以增强绿色荧光蛋白基因eGFP为标记的植物表达载体pCAMBIA2300-35S-eGFP，构建成CaMV 35S启动子和章鱼碱合成酶终止子OCS、控制同框融合基因ZmPP2C26-eGFP的植物表达载体pCAMBIA2300-35S-ZmPP2C26(LV)-eGFP和pCAMBIA2300-35S-ZmPP2C26(SV)-eGFP(图1)。经SmaⅠ/SalⅠ双酶切鉴定和菌液送样测序后，冻融法转化农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA 105菌株。经抗性培养基筛选后，挑取阳性单克隆摇菌，用花序浸染法[24]转化野生型拟南芥。

图1 ZmPP2C26基因两个可变剪接体的表达结构Fig.1 Expression structures of two alternative spliced variants of ZmPP2C26 gene

1.3 转基因植株的筛选

T0代种子收获后，播种于添加50 mg/L卡那霉素(Sigma，美国)的1/2 MS培养基筛选[25]，存活T1代植株自交产生T2代种子。T2代株系继续在相同抗性培养基上筛选，选取抗∶感分离比约3∶1的T2代株系继续自交，产生T3代种子。在相同抗性培养基上筛选抗性不分离的纯合T3代株系。用跨ZmPP2C26基因与eGFP基因的序列片段特异引物(5′-GCCCACCGTCCCCGCCTCTA-3′/5′-CTCGCCCTTGCTCACCATGG-3′)，进行转基因拟南芥阳性检测。选取纯合转基因拟南芥制作根尖切片，在荧光显微镜(90 I型，Nikon，日本)下检测绿色荧光信号。

1.4 T3代株系的表型鉴定

从上述鉴定的两个剪接体转化的T3代纯合株系中，各选20个长势均匀一致的单株，并以野生型拟南芥为对照，分别移栽至5个盛有营养土的花盆中，在25 ℃、相对湿度60%～70%、光照10 h/黑暗14 h条件下生长2个月，其中3 盆每株取2个叶片用于实时定量PCR检测(3次生物学重复)后，称取植株鲜质量，室温放置6 h，再称取萎蔫质量，按下式计算相对含水量；另外2盆植株停止浇水，实施干旱处理，待植株显现明显萎蔫症状时，拍照纪录株系间的表型差异。

用IBM-SPSS软件(http://www-01.ibm.com/software/analytics/spss/)做方差分析和两个剪接体及空白对照载体转化T3代株系间的多重比较。

1.5 实时定量PCR检测

将两个可变剪接体转化的T3株系及野生型对照的叶片样品，经液氮研磨后，用RNAiso plus kit(TaKaRa,大连)提取总RNA，用RNase-free DNase(TaKaRa,大连)去除可能的基因组DNA污染后，用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis kit(TaKaRa,大连)反转录成cDNA，用于实时定量PCR(Real-time Quantitative PCR,RT-qPCR)检测。用Primer-BLAST软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)设计两对引物，P1(5′-GAGCGGTGAAGAGGGGTTAC-3′)/P2(5′-CCCAATGCCCCTAGACACTG-3′)扩增ZmPP2C26基因cDNA第599至891碱基长293 bp片段，P3(5′-AGTATTGTTGGCCGTCCTCG-3′)/P4(5′-GGGTTAAGAGGCGCTTCAGT-3′)扩增拟南芥肌动蛋白基因AtAct1 cDNA第210到 448碱基长239 bp片段作为内参。用RT-qPCR试剂盒SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(TliRNaseH Plus)(Takara,大连)在定量PCR系统CFX96TMReal-Time System(Bio-Rad,美国)中进行扩增反应。用两步法RT-qPCR温度循环程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，循环39次。然后，将温度以0.5 ℃/s升高至95 ℃，绘制熔解曲线，用于区别特异与非特异扩增。用定量系统原配CFX MangerTM软件(Version 2.0)的2-ΔΔCt法对内参基因与目的基因的表达量进行标准化[26]。用IBM-SPSS软件(http://www-01.ibm.com/software/analytics/spss/)进行统计分析。

1.6 生物信息学分析与亚细胞定位

用ExPASy软件(http://web.expasy.org)[27]在线预测两个可变剪接体的推导氨基酸序列及其物理化学特性。用I-TASSER软件(http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER)[28], 预测其推导蛋白的三维结构。用TargetP 1.1软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)[29]，对较长剪接体保留的ZmPP2C26基因第一内含子的推导氨基酸序列进行亚细胞定位预测。

按Sparkes等[30]的方法，分别挑取含有ZmPP2C26(LV)和ZmPP2C26(SV)的农杆菌阳性单克隆摇菌，调节至OD600=0.5，用微量注射器注入烟草叶片背面，培养2 d后，在90 I 型荧光显微镜(Nikon，日本)下检测增强绿色荧光蛋白基因eGFP瞬时表达的绿色荧光信号。

2 结果与分析

2.1 ZmPP2C26两个可变剪接体的克隆

以玉米自交系B73的cDNA为模板，用ZmPP2C26基因开放阅读框特异引物进行PCR扩增，凝胶电泳分离出两条清晰的特异条带，条带大小

与1 000 bp的DNA标记相当(图2)。序列分析表明，两条特异条带分别长1 164和951 bp，其重叠区域的序列完全相同。与B73基因组DNA序列比对结果表明，在较短剪接体中切除的213 nt第一内含子，在较长剪接体的剪接中被保留(图3)。第一个内含子的剪接位点为5′-CC..CG-3′，与植物中通常的组成型剪接位点5′-GT..AG-3′不同。保留内含子及其侧翼序列的G/C含量较高，相当于其他内含子及其侧翼序列的2倍(表1)。两个剪接体推导氨基酸序列比对结果表明，PP2C蛋白的保守结构域和活性位点均保持不变，保留内含子在近N-端编码一段71个氨基酸冗余序列，其中不包含PP2C蛋白的保守序列或活性位点(图4)。

M.DNA分子标记；1.约1 000 bp的两个特异条带M.DNA molecular Marker;1.Two specific bands beside 1 000 bp图2 ZmPP2C26基因开放阅读框扩增片段Fig.2 Amplified fragments of open reading frame of ZmPP2C26 gene

图3 ZmPP2C26基因两个可变剪接体的外显子/内含子结构Fig.3 Exon and intron structures of two alternative transcripts of ZmPP2C26 gene

内含子Intron长度Length剪接位点及侧翼序列Splice sites and flanking sequences内含子G/C含量/%G/C content of intron sequence侧翼序列G/C含量/%G/C content of flanking sequences1213 nt5'-GCGGCG//CCCGCG..GCGGCG//GTGGCC-3'82.1695.832126 nt5'-AAGTG//GTAATTT..CTCAG//GCACTGT-3'35.9541.673119 nt5'-ATTTG//GTATGTC..TTCAG//GGTGGAT-3'41.1741.67

注：双斜线(//)表示内含子5′-端和3′-端的剪接位点。

Note:Double slash (//) indicates intron 5′- and 3′- splice sites.

2.2 转基因株系的表型

经T1和T2代抗性培养基筛选后，跨ZmPP2C26基因和eGFP基因特异PCR扩增结果显示，长、短两个剪接体表达载体转化分别获得8和9个纯合的T3代株系，而且根尖切片在荧光显微镜下均可检测到绿色荧光信号(图5)。在两个表达载体中，ZmPP2C26基因的长、短两个剪接体均与增强绿色荧光蛋白基因eGFP处于同一开放阅读框，说明这两个剪接体也在T3代株系中异源表达。进一步的RT-qPCR检测表明，两个剪接体在拟南芥中的相对表达水平比野生型拟南芥高6倍以上，而两个剪接体各转化株系之间的差异不显著(P>0.05)(图6)。

方差分析及多重比较表明，长、短两个剪接体转化T3代株系的相对含水量均显著低于野生型拟南芥，而两个剪接体各转化株系间无显著差异(图7)。停止浇水4周以后，两个转基因株系开始显现萎蔫症状，5周后萎蔫明显，而野生型拟南芥保持正常生长(图8)。

Mu.野生型(空白对照)；LV1～LV8.较长剪接体转化的T3代株系；SV1～SV9.较短剪接体转化的T3代株系。*、**分别表示P<0.05、P<0.01显著性。图7同Mu.Wild type;LV1-LV8.T3 lines transformed by the longer alternative spliced variant;SV1-SV9.T3 lines transformedby the shorter alternative spliced variant.*,** indicates the statistical significance at P<0.05,P<0.01.The same as Fig.7图6 两个剪接体在T3代株系中的相对表达水平Fig.6 Relative expressions of the two alternative spliced variants in the T3 lines

图7 T3株系及野生型的相对含水量Fig.7 Relative water contents of the T3 lines and the mutant

A.较长剪接体转化的T3代株系;B.较短剪接体转化的T3代株系;C.野生型(空白对照)A.T3 lines transformed by the longer alternative spliced variant;B.T3 lines transformed by the shorter alternative spliced variant;C.Wild type (negative control)图8 T3株系及野生型对干旱胁迫的表型应答Fig.8 Phenotypic responses of the T3 lines and the mutant to drought stress

2.3 ZmPP2C26两个可变剪接体的理化特性与亚细胞定位

生物信息学预测结果表明，较长和较短剪接体分别编码长388和317个氨基酸组成的蛋白质，分子量分别为40.79和34.04 ku，等电点分别为5.97和5.27。两个推导蛋白的三维结构均相似于PPM1K基因编码的人类蛋白磷酸酶1 K(GenBank注册号：BC037552)[31]。较长剪接体保留内含子编码的71个冗余氨基酸保持随机螺旋状态(图9)，其中58个氨基酸为叶绿体定位信号肽，预测保证概率为0.855。

1K.人类PPM1K基因编码的蛋白磷酸酶1K；A.较长剪接体推导蛋白的三维结构；B.较短剪接体推导蛋白的三维结构1K.PP2C domain of the protein phosphatase 1K encoded by the PPM1K gene of human;A.The predicted 3-dimensional structure of putative protein of the longer spliced variant;B.The predicted 3-dimensional structure of putative protein of the short spliced variant图9 ZmPP2C26两个可变剪接体推导蛋白的三维结构Fig.9 Predicted 3-dimensional structures of putative proteins of two alternative spliced variants of ZmPP2C26

荧光信号检测表明，注射较长剪接体表达载体的烟草叶片，可在细胞核、细胞膜和细胞器检测到增强绿色荧光蛋白基因eGFP瞬时表达的绿色荧光信号，而注射较短剪接体表达载体的烟草叶片，只在细胞核和细胞膜检测到增强绿色荧光蛋白基因eGFP瞬时表达的绿色荧光信号(图10)。

图10 ZmPP2C26基因两个可变剪接体的亚细胞定位Fig.10 Subcellular location of two alternative spliced variants of the ZmPP2C26 gene

3 讨 论

可变剪接是真核生物应答发育过程和环境胁迫，增加转录组和蛋白质组多样性的重要机制[13-17]。在动植物中，由内含子保留引起的可变剪接可改变剪接体编码蛋白的亚细胞定位和生理活性[32-35]。本研究中，较长剪接体转化在烟草叶片中瞬时表达的荧光信号，不仅与较短剪接体瞬时表达的烟草叶片一样在细胞核和细胞膜上检测到，还可在细胞器上检测到。生物信息学预测表明，在较长剪接体保留内含子近N-端编码的71个氨基酸中，有58个为叶绿体定位信号肽。较长剪接体中保留第一内含子编码蛋白的功能，有可能使整个酶蛋白的活性由细胞核和细胞膜延伸到叶绿体，这有待构建携带叶绿体标记基因的载体进行进一步定位。

可变剪接的机制复杂多样[15-16]，可变内含子的剪接位点在脊椎动物物种间高度可变[33,36-37]。但在植物中，可变剪接最主要的形式是内含子保留[13,17,38-39]。剪接位点附近的G/C含量影响可变剪接中内含子剪接位点的利用，可能与初始转录产物二级结构的稳定性有关[40-41]。保留内含子及其侧翼序列的G/C含量，一般高于其他剪接形式的内含子[13,42]。在本研究中，ZmPP2C26基因的第一个内含子在较长可变剪接体中被保留，保留内含子及其侧翼序列的G/C含量比同一基因的其他两个内含子及其侧翼序列高出 1 倍，且保留内含子的剪接位点(5′-CC..CG-3′)也与同一基因的其他两个内含子不同，而且有别于植物通常的组成型剪接位点(5′-GT..AG-3′)[43-45]。这些证据都说明，ZmPP2C26基因的第一个内含子可能是一个特殊的保留型可变内含子，这有待进一步深入研究。

蛋白质三维结构预测表明，两个可变剪接体的推导蛋白均保持PP2C的活性中心。在新近的研究报道中，ZmPP2C26基因的较长可变剪接体被命名为orphan42基因，编码孤儿转录因子家族的一个成员[46]。PP2C家族的部分成员被证实参与ABA介导的信号转导[47-49]，在逆境胁迫应答中起负调控作用[50-51]。在本研究中，长、短两个可变剪接体的异源表达，均使拟南芥野生型对干旱胁迫的敏感性增强。这一结果暗示，虽然ZmPP2C26基因不属于大多数成员参与ABA信号转导的第I亚家族[50-51]，但很可能通过可变剪接改变其功能，参与ABA介导的逆境胁迫转导，起负调控作用[2,12]。由于玉米基因组的复杂性，参与ABA信号转导的ZmPP2C家族成员，还有待进一步深入鉴定。

4 结 论

玉米蛋白磷酸酶2C基因ZmPP2C26在转录后发生可变剪接，较短剪接体中剪除的长213 nt的第一内含子在较长剪接体中被保留。保留内含子不改变编码蛋白的蛋白磷酸酶活性，预测编码一段叶绿体信号肽，有可能使其功能由细胞核和细胞膜延伸到叶绿体。两个剪接体的异源表达，均可使拟南芥野生型对干旱胁迫的敏感性增强，说明其在ABA介导的逆境信号转导中起负调控作用。