重组脂联素联合辛伐他汀防治大鼠激素性股骨头坏死的实验研究

罗 兵 袁 毅 瞿刚波 袁 俊 郝攀登 曾智江 杨家福

SANFH多由患者激素服用剂量不当, 对股骨头血供过程产生干扰, 进而产生以股骨头部分区段骨小梁与骨髓坏死为典型临床特征的疾病。它是一种进展性和致残性疾病, 约有半数患者累及双侧股骨头, 是对髋关节具有特殊破坏性的退行性病变, 最终导致髋关节功能障碍, 严重影响患者生活质量。当下, 关于脂联素含量和骨代谢水平相关性的研究不断增多, 深度也有所增加。因此, 本研究通过基础实验, 利用辛伐他汀联合细胞因子重组脂联素治疗早期大鼠激素性股骨头坏死, 观察其疗效。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源 取西南医科大学实验动物中心提供的无疾患的55只SD大鼠为研究对象, 按照治疗方法的不同分为实验组(44只)与A组(11只)。

1.2 方法 实验组依照24.5 mg/kg剂量经由大鼠腹腔穿刺注射醋酸泼尼松龙注射液, 1次/周；A组注射和实验组药剂剂量等同的生理盐水, 1次/周。两组大鼠经由6周注射后,从实验组中随机选取40只大鼠随机分为模型组(B组)、脂联素组(C组)、辛伐他汀组(D组)和脂联素+辛伐他汀组(E 组 ), 各 10只。D 组、E 组分别予以辛伐他汀 , 10 mg/kg,以1 ml生理盐水溶解后灌胃, 1次/d。C组、E组大鼠予以10%水合氯醛3 ml/kg腹腔麻醉, 在C臂引导下细针穿刺进入髋关节腔, 将5 μg重组脂联素注入髋关节腔内。A组不作任何处理, B、D组以同样的方法注射等量的生理盐水。同时注射青霉素14万U/只。对五组大鼠毛发华润度、体重、活跃性以及食物摄入量等变化进行观察, 每周均要称量其体重, 结合大鼠体质情况对饲料所处方位进行调整。经6周注射治疗后, 按照一定次序分别抽取大鼠10只/组, 致死后获取股骨, 粗略观察其形态、颜色, 进行X线常规检查,继而度量股骨头部分区段的骨密度。把刚刚获取的股骨放进10% 甲醛溶液中固定 24 h, 20% 甲酸脱钙 3 d, 以细针穿刺顺畅为脱钙效果检测标准。从矢状轴把股骨头切开, 采用石蜡对切片行包埋处理, 对细胞学体态进行观察, 最后测算空骨陷窝率, 方法为在高倍显微镜下任意选择每一切片10个高倍视野, 共计50个, 空骨陷窝率=空骨陷窝/50个骨陷窝×100%。 对各组织切片SP法行免疫组化检测, 采用软件分析法计算免疫组化阳性汇集的光密度值。对各组织切片用SP法行VEGF免疫组化检测, 计算免疫组化阳性细胞数。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差(s)表示, 采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 五组大鼠一般情况 A组大鼠食物摄入量、睡眠时间无异常, 精神优良, 对外界刺激反应敏捷, 身体重量有所增加, 对抓取行为表现出一定反抗能力。B组大鼠食物摄入量降低, 精神状态较差 , 对外界刺激反应迟缓 , 明显跛行, 毛发松散, 光泽较差, 抓取时抵抗无力。C组饮食睡眠正常, 精神尚可, 反应稍迟钝, 体重稍增加, 轻微跛行。D组饮食睡眠可,精神科, 反应少迟钝, 体重增加, 轻微跛行。E组饮食睡眠正常,精神好 , 反应敏捷 , 体重增加 , 毛发不易脱落 , 体态基本正常。

2.2 五组大鼠股骨头局部X线片情况 X线平扫结果提示A组大鼠股骨头骨质密度匀称, 没有产生典型异常。B组大鼠股骨头以扁状形态呈现出来, 骨质疏松, 骨小梁紊乱、中断,有死骨形成。C组大鼠周股骨头骨质结构轻度变扁, 骨质疏松程度相对轻微, 骨小梁轻微紊乱, 可不间断的观察到点状低密度影。D组大鼠股骨头形状大体上没有发现异常, 骨质稍疏松, 骨小梁稍紊乱, 可见点状低密度影。E组大鼠股骨头形态正常, 骨质稍疏松, 骨小梁连续, 点状低密度影较C、D组减少。

2.3 五组大鼠股骨头局部骨密度比较 A、E组大鼠骨密度(0.1843±0.0032)、(0.1743±0.0140)g/cm2高于B、C、D组的(0.0899±0.0037)、(0.1299±0.0106)、(0.1375±0.0201)g/cm2,差异有统计学意义(P＜0.05)；A组大鼠骨密度略高于E组,但差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 五组大鼠股骨头局部骨密度比较(s, g/cm2)

表1 五组大鼠股骨头局部骨密度比较(s, g/cm2)

注 ：与 A 组比较 , aP＜0.05 ；与 E 组比较 , bP＜0.05

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2.4 五组大鼠股骨头组织病理学变化

2.4.1 标本大体观察 A组大鼠在参与本次研究整个过程中, 股骨头光滑性与完整性均没有发生改变；B组大鼠股骨头产生塌陷, 关节软骨被迫分离, 颜色变暗淡；C、D两组大鼠股骨头完整性与结构稳定性基本没有改变, 但是经全面观察后发现其光泽度降低, 颜色暗淡, 体现出灰白色, 没有塌陷表征；E组大鼠股骨头结构完整性没有破坏, 且光滑度逐渐增加, 色泽日趋常态化。

2.4.2 光学检查结果 在光学显微镜下, A组大鼠骨小梁致密, 粗细适当 , 均匀排布, 时而会发现骨陷窝, 但仔细观察发现其内骨细胞结构与形态均未发生异常, 骨髓腔中脂肪细胞数目处于正常区间中；B组大鼠光学显微结果提示骨小梁零散, 结构错乱 , 能够观察到碎片 , 空骨陷窝数目相对较多, 毛细血管散乱分布, 髓腔中脂肪细胞增生现象明显, 发现纤维组织产生增生现象以及产生程度不一的炎性反应, 局部区段的骨小梁表层产生了新生骨组织。在骨小梁稀疏程度的比较中, C 、D、E组大鼠均较B组大鼠轻, 在空骨陷窝数量上也明显少于B组大鼠。E组大鼠可见骨小梁有新生骨组织形成并增粗, 结构基本恢复正常。

2.4.3 五组大鼠股骨头空骨陷窝率比较 E组空骨陷窝率(12.43±0.37)%低于B、C、D组的(28.84±1.16)%、(19.09±1.42)%、(17.99±0.73)%, 高于 A 组的 (9.10±0.72)%, 差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 五组大鼠股骨头空骨陷窝率比较(s, %)

表2 五组大鼠股骨头空骨陷窝率比较(s, %)

注 ：与 E 组比较 , aP＜0.05

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2.4.4 五组大鼠股骨头组织TNF-α免疫组化IOD值比较A组大鼠TNF-α表达程度相对较弱, 只是在软骨细胞胞浆内局部表达, C、D组TNF-α于骨细胞、造血细胞胞浆中均有不同程度的表达。E组TNF-α免疫组化IOD值(30722.46±11767.37)低于B、C、D组的(196085.20±47515.38)、(102341.65±43276.27)、(97140.39±36781.19), 高 于 A 组 的(20648.04±5518.97), 差异有统计学意义 (P＜0.05)。见表 3。

表3 五组大鼠股骨头组织TNF-α免疫组化IOD值比较(s)

表3 五组大鼠股骨头组织TNF-α免疫组化IOD值比较(s)

注 ：与 E 组比较 , aP＜0.05

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2.4.5 五组大鼠VEGF免疫组化表达比较 五组大鼠病理切片均可观察到VEGF产生不同程度的阳性表达。E组股骨头VEGF阳性细胞数(37.46±5.40)高于B、C、D组的(16.20±5.30)、(30.65±6.20)、(31.39±3.70), 差异有统计学意义(P＜0.05)；与A组的(37.04±4.50)比较, 差异无统计学意义 (P＞0.05)。见表 4。

表4 五组大鼠VEGF免疫组化表达比较(s)

表4 五组大鼠VEGF免疫组化表达比较(s)

注 ：与 E 组比较 , aP＜0.05

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3 讨论

目前激素的不合理应用导致股骨头坏死的发病率已超过外伤所致的股骨头坏死, 然而对于激素性股骨头坏死的发病机制尚有争议［1］。脂肪栓塞学说认为由于激素蓄积引起血液粘稠度增高, 血管中脂肪栓塞就会诱发股骨头血供障碍, 缺血坏死通常是最后结局［2］。

脂联素是为一类机体中普遍存在的细胞因子, 其最大的特征体现在具备多样化生物学功能方面上。对骨代谢效率产生影响的同时, 有研究发现, 在脂肪组织内脂联素与TNF-α存在互为拮抗的关系。脂联素可促使TNF-α对NF-kB的活化效能降低, 进而促使关节炎模型小鼠关节中炎性因子指标降低, 阻断炎性反应对关节结构完整性的损伤过程［3-5］。

TNF-α不仅参与炎性反应过程, 在骨质吸收与再建过程发挥的作用也是不容忽视的, 其能够对碱性磷酸酶的生物活性产生阻滞作用, 进而影响骨形成效率［6-9］。有研究发现, 高血压鼠给予激素诱导后血浆TNF-α含量是激素给予前的1.5倍有余；也有报道显示［10］, 激素性股骨头缺血坏死者活组织内可溶性TNF 的含量是创伤性股骨头坏死活组织内的3倍。

综上所述, 脂联素联合辛伐他汀对VEGF 等细胞因子的分泌过程起到正向作用, 进而提升股骨头心血管与新骨生成效率, 能提高VEGF 阳性成骨细胞率 , 从而修复骨坏死 , 有助于减轻患者疼痛感, 延缓缺血坏死症状发展过程。