葡萄褪黑素昼夜节律变化及果实套袋对其影响

仝亚军，高玉录，翟衡，杜远鹏，孙庆华*

（山东农业大学园艺科学与工程学院，山东泰安 271018）

褪黑素（Melatonin，MT）又名N-乙酰-5-甲氧基色胺，为吲哚类物质[1]，在动物中参与调节昼夜节律，在夜间观察到最高浓度水平，并在白天降低到几乎检测不到的水平，因此被称为黑暗激素。五羟色胺（5-HT）作为MT的合成前体可以被羟色胺-N-乙酰基转移酶催化为N-乙酰-五羟色胺[2]。MT的代谢产物包括2-羟基褪黑素（2-OH）、4-羟基褪黑素、6-羟基褪黑素等，其中最主要的为2-OH（99%），其次为4-羟基褪黑素（0.05%）[3]。

脊椎动物中MT主要由松果体产生，再分泌到血液中。由于松果体的生理活性受光周期环境的影响[4]，所以褪黑激素的合成和分泌也受到光周期影响而表现出昼夜节律，在光周期的黑暗期合成并分泌[5]，在苏醒时达到最高水平，而光照会抑制脊椎动物中褪黑激素的产生[6]，褪黑激素的昼夜节律也会随着衰老和某些医学疾病（包括心脏疾病和神经退行性疾病）而受到损害[7]，因此在动物中MT与睡眠有明显的关联。

研究表明，植物中MT的含量同样存在昼夜变化规律。一般在黑暗条件下植物MT含量上升，如在短日照植物红黍中，光照期间几乎检测不到MT，而在暗期含量上升，且于光期开始前的4～6 h达到最大值，这与动物体中MT合成的昼夜节律非常相似。后来发现黄芩和水葫芦中的MT也存在着同样昼夜变化[8-9]，然而也有一些研究报道番茄、牵牛花、芦荟和贯叶连翘植株中的MT含量并不存在昼夜差异，而樱桃果实中的MT含量在昼夜24 h内出现两个高峰。由上述结果可以看出，不同植物中的MT合成昼夜节律可能存在较大差异，而葡萄中MT合成的昼夜节律目前还未见到报道。因此本研究以‘美乐’的果皮和叶片及‘摩尔多瓦’的果皮为试材，探讨葡萄上MT及其前体物质的昼夜变化规律及套袋对其昼夜节律的影响。

1 材料与方法

1.1 试材与处理

试验于2017年7～9月山东农业大学园艺学院葡萄试验基地进行。以田间6年生篱架栽培的‘美乐’（Vitis vinifera cv Merlot）和‘摩尔多瓦’（Moldova，Guzalkara×SV.12-375）为试材。南北行向，2.2 m×1.2 m，单臂单干垂直叶幕，栽培管理一致。其中对‘摩尔多瓦’部分果穗在6月15日进行了套纸袋处理，‘美乐’未套袋。7月22日对‘美乐’果实及‘摩尔多瓦’的套袋果及不套袋果进行采样，昼夜采样时间分别为16时、20时、24时、4时、6时、8时、12时。每个品种每个处理选长势一致的3株，重复3次，共9株。每株选取西侧统一部位的果穗迅速带回实验室，在冰上将果粒剪下快速将果皮与果肉分离，用液氮将果皮冷藏。经前期测定果肉中MT含量极少，所以本试验材料仅取果皮。另外，还分别于7月22日和9月3日与果实采摘同步时间采摘‘美乐’叶片，每处理每植株上部选取一片成熟叶片，叶片摘下后立刻液氮速冻。

1.2 测定指标与方法

取液氮速冻样品置于冷冻干燥机冻干（≥48 h）后，称取葡萄果皮/叶片样品0.5～1.0 g（冻粉2.0～3.0 g），在液氮冷冻状态下用冷冻磨样机研磨成干粉，置于10 mL试管中，加5 mL纯分析级甲醇振荡混匀，使其充分溶解。涡旋机涡旋震荡，然后用超声波清洗机低温超声提取15 min（300 w）。静置12 h后，在4 ℃下用12 000 r/s离心15 min，收集上清液并用0.22 μm有机滤膜进行过滤，滤液置于新试管中。再次加入5 mL的分析级甲醇进行二次离心10 min，收集上清液并用0.22 μm有机滤膜进行过滤。低温旋转蒸发（不超过30 ℃，避光）。将蒸干后的物质用3 mL 5%甲醇水溶液分3次重新溶解，经0.22 μm滤膜过滤到新5 mL试管中。SPE固相萃取后定容到1 mL，经高效液相色谱-荧光（TSQ-Quantum-Access-MAX三重四极杆）检测。5-HT、MT和2-OH的检测参数为：激发波长λex＝288 nm；发射波长λem＝333 nm；参数柱温：25 ℃；跑样时间：8 min；初始流动相比例甲醇∶水（0.05%乙酸）＝20∶80；梯度洗脱：0 min/80 H2O→0 min/80 H2O→0.8 min/80 H2O→2 min/40 H2O→5 min/40 H2O→5.1 min/80 H2O→8 min/80 H2O；进样量：5 μL。

2 结果与分析

2.1 ‘美乐’果皮中5-HT、MT和2-OH的昼夜节律

图1 ‘美乐’葡萄果皮三种物质的昼夜节律（7月22日）Figure 1 Circadian rhythms of three substances of 'Merlot'grape peel (July 22)

如图1所示，作为MT合成前体的5-HT自下午16时至24时浓度达到较高水平，为14.47～11.23 ng/g，其后急剧下降，从凌晨4时至中午12时变化于0.27～2.54 ng/g；相应的MT在16时至4时浓度维持在较高的0.60～0.72 ng/g，其后缓慢下降，8时至12时维持在0.25 ng/g，浓度水平高于其前体。其代谢产物2-OH的峰值为14.47 ng/g同样出现在16时，除了晚8时和上午8时分别有两次下降，20时达到最小值0.96 ng/g，其他时间均保持较高的浓度水平。测定表明，‘美乐’葡萄果皮内的MT浓度随时间的变化具有明显的昼夜节律。

2.2 ‘美乐’叶片中5-HT、MT和2-OH的昼夜节律

图2 ‘美乐’不同时期叶片中MT、5-HT和2-OH浓度Figure 2 Concentrations of 5-HT, MT and 2-OH in leaves of'Merlot' during different periods

为了查看功能叶片和衰老叶片MT的差异，选择7月22日和9月3日的‘美乐’叶片测定5-HT、MT和2-OH的浓度变化，结果如图2所示。‘美乐’叶片中5-HT的浓度7月22日略高与9月3日，浓度均在0.2 ng/g到0.4 ng/g。MT浓度7月平均浓度为0.88 ng/g，明显高于9月0.028 ng/g，7月叶片中MT浓度在8时最高，最高浓度达到1.93 ng/g；9月叶片中MT浓度比较低，最高浓度为12时0.1 ng/g。2-OH浓度7月的浓度略高于9月，前者4时浓度最高为17.2 ng/g。结果表明，葡萄果皮中MT含量夜间处于较高水平，白天浓度降低。

2.3 套袋对‘摩尔多瓦’果皮中5-HT、MT、2-OH昼夜节律的影响

图3 套袋对‘摩尔多瓦’果实5-HT、MT及2-OH浓度的影响Figure 3 Effect of bagging on the concentrations of MT, 5-HT and 2-OH in 'Moldova' fruits

如图3所示，套袋和未套袋的‘摩尔多瓦’葡萄果皮中5-HT浓度均较低，保持在0.5 ng/g以下，夜间5-HT含量逐渐升高达到峰值后逐渐降低，并且套袋处理后5-HT出现峰值时间由24时推迟到6时，峰值由0.22 ng/g到0.26 ng/g。MT夜间16时至24时维持在较低水平1 ng/g内，套袋处理后MT平均含量由0.81 ng/g升高到1.60 ng/g。套袋处理后MT含量明显升高，4时达到峰值4.19 ng/g，8时到12时套袋和未套袋果皮中MT浓度均上升，并且未套袋上升幅度明显高于套袋处理。如图3C所示，未套袋处理的果皮中2-OH含量呈下降趋势，6时出现峰值；套袋处理后2-OH夜间峰值出现在24时（9.18 ng/g），提前了6 h。结果表明，经套袋处理后中午12时5-HT浓度提高，MT浓度明显低于未套袋。

3 讨论与结论

MT作为明暗周期调节剂的作用在哺乳动物中早已得到了证实。近年来，在植物中发现MT也存在着类似于动物中的昼夜节律，在光照期间水平低，而在黑暗中显著增加达到最大水平。但也有人发现在某些植物中MT的合成存在不同于动物的节律，如番茄、牵牛花、芦荟中的MT含量并不存在昼夜差异[9]，而樱桃果实、芍药花瓣中的MT含量昼夜日变化含量在2时和14时有两个峰值点，一个可能与黑暗有关，另一个可能与氧化应激反应有关，即高温和光强[10]。由此可见，MT的合成不仅与光照有关，与温度等其他环境因素也关系密切，而且不同植物MT合成的昼夜节律也可能存在差异。本研究发现，葡萄叶片和果皮中MT合成随着温度和光照强度的变化呈现相应的变化。‘美乐’果皮中5-HT、MT和2-OH这三种物质都是晚上高，白天低；而‘摩尔多瓦’果皮中5-HT含量在24时达到最高峰，14时又会出现一个小高峰；而MT含量晚上一直较低，到中午12时才有一个高峰；2-OH也在中午及下午维持较高浓度，估计与其抗高温光照胁迫有关。可见不同葡萄品种MT的昼夜节律也存在差异。通过测定‘美乐’葡萄叶片中5-HT、MT和2-OH含量也与其果实有类似规律，但高峰值有所延后。此外，本研究还发现处于功能盛期的‘美乐’叶片比秋季衰老叶片中MT平均浓度明显要高，说明植物衰老影响MT浓度，这与在桑叶MT含量顶端＞幼叶＞老叶一致[11]。基于以上结果，我们推测葡萄上MT代谢存在昼夜节律，并且黑暗环境有利于MT的累积，同时光强如果过高也会促进MT的合成。

MT被证明是一种有效的自由基清除剂和广谱抗氧化剂[12]。有研究发现，紫外辐射会使植物体内产生过量自由基造成伤害，而MT在藻类和高等植物中具有抵御紫外线伤害的能力，将甘草的根置于紫外线下3 d，其内源MT含量是白光对照的4～5倍，表明植物可提高MT浓度来抵抗紫外线造成的氧化伤害[13]。但也有不同的研究结果，如李超[14]也发现树冠外围苹果果皮MT含量高于内膛果果皮，东南向苹果果皮MT含量明显高于西北向苹果果皮，未套袋果的果肉和果皮中MT含量显著高于套袋果，但在摘袋后果皮中的MT含量迅速增加。Riga等[15]发现，遮阴条件下大部分番茄果实中MT含量明显提高，而大部分辣椒果实中MT含量却呈现下降的趋势。本研究发现，晚上套袋果皮MT含量高于未套袋，但白天未套袋葡萄果皮中MT含量升高较快，在中午12时未套袋处理MT浓度明显高于套袋处理，这可能与当天中午12时外界温度和光强过高有关，高温高光强会促进植物内源MT合成，从而保护果实免受高温及光氧化胁迫的侵害。