外源对羟基苯甲酸对葡萄植株生长及根系分泌特性的影响

孙鑫，刘倩文，李坤*，郭修武*，郭印山，刘镇东

（沈阳农业大学园艺学院，辽宁沈阳 110161）

据统计，到2016年世界葡萄的栽植面积已达751.6万 hm2，产量为7580万 t[1]。然而随着连作年限的増加，大范围的葡萄栽培区都出现了连作障碍。现已证实自毒作用是葡萄连作障碍发生的重要原因，且对羟基苯甲酸（4-HBA）是葡萄根系分泌的主要酚酸类自毒物质[2]。酚酸类物质能通过改变抗氧化酶活性而影响植物的生长发育。陈天祥等[3]研究发现，50～150 mg/kg 4-HBA和苯丙烯酸处理显著促进设施黄瓜幼苗体内超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD)活性的增加。李自龙等[4]发现150～200 mg/L外源酚酸（4-HBA、香草酸、阿魏酸）处理显著提高了马铃薯叶片的丙二醛（MDA）含量，并对应着抗氧化酶活性的整体下降。自毒物质不仅能够影响植株的生长，而且还能改变根系分泌特性，进而对根际微生态产生影响。李勇等[5]利用邻苯二甲酸二异丁酯、丁二酸二异丁酯、苯甲酸等自毒物质处理人参，结果表明处理后大多数人参根系分泌的酚类和酚酸类物质种类均有所増加。董彦[6]选用根系及土壤浸提液对平邑甜茶幼苗进行胁迫处理，发现抑制了根系分泌物中的苯甲酸、4-HBA、根皮苷和没食子酸，促进咖啡酸分泌。根系浸提液还促进根皮素，抑制儿茶素的分泌，土壤浸提液可以促进肉桂酸的分泌。可见，自毒物质不仅能够影响植株的抗氧化酶活性，而且还能改变根系的分泌特性。本试验以‘贝达’实生苗为试材，采用4-HBA对葡萄进行胁迫处理，研究根系保护酶、酚酸代谢关键酶活性及根系分泌酚酸含量的变化，旨在明确4-HBA对‘贝达’葡萄幼苗造成胁迫的自毒作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为‘贝达’葡萄（V.riparia×V.labrusca，Beta）实生苗。种子取自沈阳农业大学葡萄试验基地，层积处理后，先用2%次氯酸钠（NaClO）溶液消毒20 min，再用自来水浸泡24 h，恒温恒湿培养箱中避光催芽，在种子露白时播种。试验用基质为土∶草炭∶沙子＝6∶3∶1（v/v），播种于营养土中后放到光照培养箱中进行培养，光照和黑暗对应时间为14 h和10 h，对应温度分别为26 ℃和19 ℃。光照度为4000 Lx，相对湿度75%，每隔1 d用自来水浇灌。

1.2 4-HBA处理

在‘贝达’幼苗长出4～5片真叶时，选取长势一致的幼苗，将其小心从土壤中取出，放入装有3.5 L 1/8 Hoagland营养液的塑料方盆中。每盆20株，根部避光培养，利用增氧机每隔30 min通气15 min。在水培条件下预培养3 d后，向营养液中加入浓度分别为0 μmol/L、250 μmol/L、500 μmol/L、1000 μmol/L的4-HBA溶液（其标准液用0.3%的乙醇溶液配制），0 μmol/L处理作为对照（CK）。将培养液敞口放置过夜，使酒精充分挥发。分别在处理后的当天、第24、48、96 h采集葡萄根系。将根系保存于-80 ℃冰箱中，用于测定SOD、MDA、苯丙氨酸解氨酶（PAL）等指标。

1.3 植株生物量的测定

‘贝达’植株的株高和地上、地下鲜重均在处理后96 h取样测量，采用常规方法进行测量。‘贝达’葡萄株高采用卷尺进行测量，范围包括茎尖生长点到茎的基部；幼苗的地上部和根系用清水冲洗，用纸擦干，测定鲜重。

化感作用效应敏感指数（R I）的计算采用Willianmson的方法[7]。RI＝1－C/T(T≥C)，RI＝T/C－1(T＜C)。式中，C代表对照值，T代表处理值。当RI＞0时，则表示促进作用；当RI＜0时，则表示抑制作用。化感作用的强度可通过RI绝对值的大小来表示。

1.4 植株生理生化指标的测定

SOD活性按照Giannopolities和Ries的氮蓝四唑法测定并加以修改[8]。MDA含量按照Kramer[9]中描述的硫代巴比妥酸法测定。PAL活性测定按照焦蒙丽等[10]的方法并稍作改动。酶液提取：称取葡萄根系样品0.5 g，加入5 mL在4 ℃下预冷的提取介质（含0.05 mol/L硼酸缓冲液、5.0 mmol/L巯基乙醇、5%甘油、1.0 mmol/L EDTA-Na2，pH8.8）和少量pvp，在冰浴下迅速研磨成匀浆后过滤，滤液在4 ℃下4000 r/min离心15 min，吸取上清液，用于检测酶活性。

酶活性的测定体系中包括0.5 mL粗酶液，2 mL pH8.8的硼酸缓冲液，1 mL 0.02 mol/L的L-苯丙氨酸和1 mL的蒸馏水，对照组将L-苯丙氨酸换为同等体积的蒸馏水。将反应液于30 ℃水浴60 min后，加入0.2 mL 6 mol/L盐酸终止反应。在290 nm波长下测定吸光度，以每分钟OD值变化0.1为一个酶活单位U。

1.5 根系分泌物中酚酸含量测定

根系分泌物的收集：取长有4～5片真叶、长势一致的‘贝达’实生苗，小心去掉根部的土壤，将20株葡萄苗放入装有1 L蒸馏水的小桶中，利用增氧机每隔30 min通气15 min，每5 h收集一次，共收集5 L，收集液即为根系分泌物，置于4 ℃保存。将5 L收集液混匀、定容、过滤，于40 ℃下减压浓缩至25 mL。将已浓缩的25 mL根系分泌物通过XAD-4树脂柱，利用5倍柱体积的甲醇解析后，于40 ℃下减压浓缩至干，溶于1 mL甲醇，待测。

液相色谱检测条件：C18色谱柱（4.6 mm×250 mm），流动相为0.1%的甲酸和甲醇，梯度洗脱，流速为0.8 mL/min，VWD检测器，波长280 nm，进样量10 μL，柱温30 ℃。

4-HBA标准样品的线性方程：y＝77.178x＋0.6084，R2＝0.9986；香草酸标准样品的线性方程：y＝81.839x＋0.3741，R2＝0.9997；阿魏酸标准样品的线性方程：y＝14.577x＋0.9582，R2＝0.9987；苯甲酸标准样品的线性方程：y＝19.975x－0.3002，R2＝0.9995；水杨酸标准样品的线性方程：y＝139.38x－0.7239，R2＝1；肉桂酸标准样品的线性方程：y＝60.442x＋0.4587，R2＝0.9978。

1.6 数据分析

数据利用IBM SPSS 20.0软件进行统计分析，方差分析选用ANOVA过程，采用Tukey's HSD test显著性检验。

2 结果与分析

2.1 4-HBA对‘贝达’葡萄幼苗生长的影响

由表1可以看出，总体来说4-HBA处理抑制了‘贝达’葡萄水培幼苗的生长。除250 μmol/L 4-HBA处理后，地下鲜重高于对照外，其他浓度4-HBA对株高、地上鲜重、地下鲜重均有抑制作用，并且随着4-HBA浓度的提高抑制作用越显著。3种4-HBA浓度处理下，植株高度分别比对照降低了1.96%、5.73%、5.80%，地上鲜重分别比对照降低了24.80%、38.68%、58.66%。4-HBA对地下鲜重的影响呈现出低浓度促进高浓度抑制的现象。

2.2 4-HBA对‘贝达’幼苗根系SOD活性的影响

如图1所示，在处理后24 h，4-HBA浓度为250、500 μmol/L时，SOD活性较对照分别降低4.29%和7.94%。在处理后48 h，所有处理SOD酶活性均高于对照，分别上调了26.56%、15.33%、9.65%。在处理后96 h，500 μmol/L和1000 μmol/L处理下，SOD活性显著低于对照，分别降低了19.38%和23.89%。结果表明，随着处理时间延长，低浓度4-HBA可提高‘贝达’葡萄水培幼苗根系SOD活性，而高浓度4-HBA则抑制根系SOD活性，抑制植株生长。从处理时间来看，在处理后的48 h，SOD活性达到峰值。

2.3 4-HBA对‘贝达’幼苗根系PAL活性的影响

图1 4-HBA处理对‘贝达’幼苗根系SOD活性的影响Figure 1 Effect of 4-HBA treatment on SOD activity in 'Beta'seedling roots

表1 4-HBA处理对‘贝达’幼苗生长的影响Table 1 Effects of 4-HBA on the growth of 'Beta' (V.riparia×V.labrusca cv.) grape seedlings

PAL是促进苯丙烷类代谢途径生成各种酚酸类物质的第一步反应酶，也是苯丙烷类代谢途径的关键酶和限速酶。PAL与植物抗逆境性密切相关。由图2可以看出，PAL活性随着4-HBA处理浓度的升高，呈现出先上升后下降的趋势。在处理后24 h，250 μmol/L处理PAL活性较对照增加了10.66%，500 μmol/L和1000 μmol/L处理PAL活性与对照无显著差异。PAL活性在处理后48 h达到峰值，各处理PAL酶活性均显著高于对照，分别为对照的1.16、1.32、1.24倍。处理后96 h各浓度处理关键酶活性都比处理48 h有所下降。可见，4-HBA胁迫后，葡萄植株能够通过提高PAL活性来增强植株的适应能力。

2.4 4-HBA对‘贝达’幼苗根系MDA含量的影响

MDA是膜脂过氧化过程中最重要的产物之一，其产生和积累能够导致膜损伤的加剧。在4-HBA处理后24 h，根系MDA含量随处理浓度增加而增大，较对照分别增高了7.04%、12.49%、14.54%。处理后48 h，根系MDA含量较对照分别增高了31.46%、26.02%、37.56%；在4-HBA处理后96 h，高浓度处理根系MDA含量最高，显著高于对照及其他处理。

2.5 外源4-HBA对‘贝达’幼苗根系分泌酚酸的影响

图2 4-HBA处理对‘贝达’幼苗根系PAL活性的影响Figure 2 Effect of 4-HBA treatment on PAL activity in 'Beta'seedling roots

由表2可以看出，各浓度处理后，根系分泌物中4-HBA含量和阿魏酸含量较高。在处理后4-HBA含量均显著低于对照，250 μmol/L处理，根系分泌物中的4-HBA含量最低，仅为对照的11.86%；500 μmol/L和1000 μmol/L时，根系分泌物中的4-HBA含量较对照分别降低了26.59%、55.37%。外源4-HBA处理，促进了根系分泌更多的水杨酸。在无4-HBA处理下，根系分泌物中水杨酸酸含量仅0.0409 μg/mL，随着4-HBA处理浓度增加，根系分泌物中水杨酸酸含量分别达到了0.61、0.86、5.05 μg/mL。1000 μmol/L 4-HBA处理使根系分泌物中水杨酸含量显著增加，为对照的124倍。4-HBA处理下肉桂酸含量均低于对照，分别比对照降低了46.00%、26.07%、66.48%，且在4-HBA处理浓度为1000 μmol/L时，根系分泌的肉桂酸含量最低。4-HBA处理后，改变了根系分泌的苯甲酸含量，在处理浓度为250 μmol/L和500 μmol/L时，根系分泌苯甲酸含量均低于对照，分别降低了44.22%和21.91%。而高浓度处理则使根系分泌物中苯甲酸含量显著增加，为对照的2.4倍。处理96 h后，在4个浓度4-HBA处理下，根系分泌物中阿魏酸含量分别为17.89 μg/mL、36.74 μg/mL、62.71 μg/mL、111.03 μg/mL，且阿魏酸含量变化与外源4-HBA浓度呈正相关。4-HBA处理后，根系分泌的香草酸含量呈现出先增加后降低的趋势。当处理浓度为250 μmol/L时，香草酸含量达到峰值，为对照的1.28倍。当4-HBA浓度为1000 μmol/L时，香草酸含量显著降低，较对照降低了37.23%。外源4-HBA处理为250 μmol/L时，‘贝达’葡萄水培幼苗根系分泌的总酚酸含量显著降低，较对照降低了59.77%。而高浓度4-HBA处理使‘贝达’葡萄水培幼苗根系分泌出更多的酚酸，较对照分别增加了22.56%、29.49%，且在4-HBA处理为1000 μmol/L时达到峰值。

图3 4-HBA处理对‘贝达’幼苗根系MDA的影响Figure 3 Effect of 4-HBA treatment on MDA content in 'Beta'seedling roots

表2 4-HBA处理96 h后‘贝达’葡萄根系分泌物中的酚酸含量 （单位：μmol/L）Table 2 Phenolic content in 'Beta' root exudates under 4-HBA treatment after 96 h (Unit: μmol/L)

3 讨论与结论

在植物正常的生长条件下，因为抗氧化系统的参与，其体内活性氧的产生与消除处于平衡状态。SOD是清除超氧阴离子自由基的形成和积累的重要酶类，可以反映出植物抵抗逆境胁迫的能力[11]。而MDA含量是间接测定植物膜系统受损程度以及抗逆性的一个常用指标。本试验结果表明，‘贝达’葡萄根系SOD酶的活性随着处理时间的延长呈现出先上升后下降的趋势，在处理后96 h，低浓度酚酸促进SOD酶活性，高浓度抑制其活性，且与对照达到显著差异。有研究表明，适当的低温和渗透胁迫能使SOD等保护酶活性上升，中间和高浓度使其活性下降[12-13]。本试验随着外源酚酸处理浓度的增加，MDA的含量大量积累，在不同的处理时间下，1000 μmol/L的4-HBA处理葡萄根系MDA含量始终高于对照，并达到显著性差异。这一研究结果与与黄彩红[14]研究结果相一致，其研究发现随着外源酚酸处理浓度增加，黄瓜根系MDA含量持续升高。说明在高浓度酚酸物质刺激根系细胞膜脂过氧化的发生，细胞膜结构受到破坏，根系的生理生化过程受阻，超出了抗氧化酶系统的保护能力。

研究表明，外源胁迫因子可影响次生代谢途径中的关键酶，进而影响植物次生代谢物的合成和积累量[15]。而植物根系分泌物的组成与含量变化是响应环境胁迫时最明显和直接的反应之一[16]。PAL作为一种生物合成酶，可以催化多种具有防御功能化合物的形成[17-18]。有研究发现，水杨酸处理杜鹃叶片可明显诱导PAL防御酶活性的提高[19]。Latunde等[20]也研究发现用水杨酸处理豇豆幼苗，500 μmol/L以上就能激活PAL基因的表达，使PAL酶活性增加。前人在对洋甘菊根系进行外源水杨酸处理后发现，其PAL酶活性升高，从而导致植株分泌的可溶性总酚含量显著增加[21]。Zafari等[22]以牧豆树为试材研究发现，在铅（Pb）处理初期，PAL活性与酚类化合物的增加呈正相关，且随Pb处理浓度增大，阿魏酸和水杨酸含量均显著增加[22]。本研究发现外源4-HBA处理可以显著影响‘贝达’水培幼苗根系的PAL酶活性。随着处理时间的延长，PAL酶活性呈现出先上升后下降的趋势，在48 h酶活性达到峰值。且4-HBA处理导致根系分泌的4-HBA，肉桂酸含量减少，水杨酸和阿魏酸含量显著增加。酚类化合物的积累在植物对生物和非生物胁迫的反应中起关键作用[23-24]，其中水杨酸是能激活植物防御反应的重要信号分子。因此，我们认为在外源酚酸胁迫下可刺激葡萄根系分泌出更多的水杨酸来参与植物的防御代谢反应。