代谢组学分析提高谷氨酸棒杆菌L-瓜氨酸产量

许 娟，许 琳，郝 宁

(南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 211800)

代谢组学(metabolomics)是以机体内所有代谢物为研究对象，利用高通量分析方法，研究生物体系对内外扰动响应情况的学科[1]，致力于全面分析代谢网络调控及其关联性[2-3]。代谢组学是组学研究的终点，它以细胞内所有分子量小于1 000的代谢物为对象，进行系统的定性、定量分析，以其代谢物的变化继而挖掘生物体系的代谢表型改变，最接近于生物表型。目前代谢组学研究广泛应用于微生物领域。

L-瓜氨酸首次在西瓜中分离得到[4]，是人体尿素循环的重要参与物质。L-瓜氨酸可以提高免疫系统功能、舒张血管、维持正常的胆固醇和血糖水平、治疗关节炎症[5-9]。因此在食品、医药等行业，L-瓜氨酸应用越来越广泛[10]。

谷氨酸棒杆菌是氨基酸发酵生产行业最常用的工业菌种。本研究利用基于气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析手段的代谢组学方法，以实验室保藏的谷氨酸棒杆菌标准菌株ATCC 13032和改造后的L-瓜氨酸高产菌CorynebacteriumglutamicumATCC 13032ΔargGΔargR-pXMJ19-argB(ec) (CIT4)为研究对象，分析确定影响瓜氨酸合成的关键代谢物质与代谢途径，确定瓜氨酸合成的限定条件，通过挖掘胞内L-瓜氨酸合成的不足性，提出优化添加前体物质的方案，以期理性有效地提高谷氨酸棒杆菌生产L-瓜氨酸的产量。

1 材料与方法

1.1 菌株

C.glutamicumATCC 13032、C.glutamicumATCC 13032ΔargGΔargR- pXMJ19-argB(ec) (CIT4)，南京工业大学微生物保藏室保存。

1.2 试剂和仪器

吡啶、N-甲基-N-(三甲基硅氧烷基) 三氟乙酰胺(MSTFA)等衍生化试剂，Sigma-Aldrich 公司；甲醇、乙腈等(AR)，上海凌峰化学试剂有限公司。

Trace GC 2000 DSQ型气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)，美国Agilent 公司；QYN100-2型氮气浓缩仪，上海乔跃电子有限公司；D5321型高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；Ultimate 3000型高效液相色谱仪，DioNex中国有限公司。

1.3 培养基

固体培养基(g/L)：蛋白胨 10、酵母粉 5、NaCl 10、琼脂 20。

发酵培养基M1(1 L)：葡萄糖80 g、KH2PO41.0 g、K2HPO4·3H2O 1.0 g、FeSO4·7H2O 0.02 g、MnSO4·H2O 0.02 g、ZnCl21 mg、VB1200 μg；pH 7.0。

发酵培养基M2(1 L)：葡萄糖80 g、KH2PO41.0 g、K2HPO4·3H2O 1.0 g、FeSO4·7H2O 0.02 g、MnSO4·H2O 0.02 g、ZnCl21 mg、VB1 200 μg；pH 7.0。

在发酵过程中，于12 h补加终质量浓度为1.0 g/L的谷氨酸和鸟氨酸，24 h补加终质量浓度分别为1.5、1.5和2.0 g/L的α-酮戊二酸、氨甲酰磷酸以及谷氨酰胺，36 h补加终质量浓度为1.0 g/L的丙酮酸。

1.4 胞内代谢物的提取

1)取样点取发酵液10 mL，迅速加入20 mL-80 ℃预冷的60%(体积分数)甲醇- 0.9%(质量分数)NaCl溶液，离心收集菌体，并用10 mL 0.9%NaCl洗菌2次，冻于液氮中。

2)加入0.5 mL -20 ℃预冷的70%甲醇，涡旋混匀，液氮反复冻融3次后8 000 r/min 冷冻离心5 min，取上清于新管中。

3)再加入0.5 mL-20 ℃预冷的甲醇-乙腈-水溶液(体积比为2∶ 2∶ 1)，涡旋混匀后，8 000 r/min 冷冻离心5 min，吸取上清与之前的清液混合。

1.5 样品衍生化

取150 μL提取液并加入30 μL内标混合液(0.2 mg/mL核糖醇)，混匀后N2吹干；在干燥的样品中加入40 μL甲氧胺盐酸盐的吡啶溶液(120 mg/mL)，40 ℃水浴反应30 min；再加入80 μLN-甲基-N-(三甲基硅氧烷基)三氟乙酰胺(MSTFA)，30 ℃水浴反应90 min。

1.6 代谢物的检测

GC-MS检测条件参照文献[11]。

1.7 代谢物数据的分析

将GC-MS所得的质谱峰导入到AMDIS软件，并与NIST数据库比对，对质谱峰进行定性分析；将质谱峰面积与内标峰面积对比进行定量分析，使得代谢物含量标准化。所有定量化的多维数据导入到Expander(version 6.0)软件中，进行聚类分析得到热图。然后将分析结果带入SIMCA-P(version 11.0)软件中，得到主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS)分析图，并且利用载荷图、T-test以及变量重要性因子(VIP)找出生物标志物[12]。

2 结果与讨论

2.1 标准菌与重组菌发酵过程比较

对L-瓜氨酸生成过程的相关发酵参数监测，从而考察菌体中各个发酵参数变化的趋势，借此系统地考察标准菌ATCC 13032和重组菌CIT4的差异性，结果见图1。

图1 ATCC 13032与CIT4菌株发酵参数曲线 Fig.1 Fermentation parameters of C.glutamicum CIT4

由图1可知：2株菌的生长曲线，将细胞生长分为延滞期(0～24 h)、对数生长期(24～36 h)、稳定期(36～48 h)和衰退期(48～60 h)。与标准菌株ATCC13032相比，CIT4菌株生长期有所延长，并且L-瓜氨酸质量浓度为18.50 g/L，而标准菌ATCC 13032没有L-瓜氨酸的生成。

2.2 发酵过程中胞内代谢物的分析

基于GC-MS代谢轮廓分析的方法，进一步研究比较两种菌体的胞内物质动态代谢差异。在发酵的4个阶段，分别从C.glutamicumATCC 13032和C.glutamicumCIT4中取样，共定量检测出124种化合物，其中86种被鉴定，包括19种氨基酸、28种有机酸、12种糖类和糖醇及9种脂类、4种醇类、5种胺类及9种其他类型代谢物，结果见图2。由图2可知：在重组菌CIT4中，发酵至24 h后，胞内谷氨酸、4-氨基丁酸、L-赖氨酸、缬氨酸的代谢水平较高，说明此时CIT4菌株胞内氮代谢比ATCC 13032菌株中的旺盛[13]，氮元素作为组成微生物中几乎所有的生物大分子的必需组分，尤其在氨基酸代谢中起着极为关键性的作用，因而对L-瓜氨酸的合成产生关键影响[14]。

红色代表代谢物浓度高；绿色代表代谢物浓度低图2 CIT4与ATCC 13032胞内代谢物的热图Fig.2 Heat map representation of metabolites in CIT4 and ATCC 13032

2.3 多元统计分析胞内关键物质

为了深入比较C.glutamicumATCC 13032与C.glutamicumCIT4的总代谢物轮廓的差异性，将GC-MS检测到的近百种的代谢物的动态变化使用主成分分析(principal component analysis，PCA)进行分析。在无监督的PCA分析，通过线性变换以减少多个变量的维度并在新的多变量空间中表示其样本分布[15]。图3为CIT4与ATCC 13032样品的主成分分析结果。

图3(a)为PCA得分图，分析结果的得分图可以直接展示出胞内代谢的变化情况。PCA模型的R2(X)值为0.931 6，表明了PCA具有较好(>0.8)的可信度。一个点表示一个代谢通量，从而可以直观区分各个体系，并且CIT4与ATCC 13032的两组数据存在着明显的离散分组的现象，这说明两株菌在相同培养基中不同的培养阶段下胞内物质存在着显著的差异。

图3(b)的PCA载荷图，通过GC-MS测得的86种胞内代谢物在载荷图各有分布，以各物质到原点的距离来判断其对L-瓜氨酸生成的作用程度，变量离原点越远，反映其在发酵过程中的变化越大，对目标产物L-瓜氨酸合成的贡献越大。

图4为偏最小二乘法(PLS)分析的变量重要因子(VIP)图，VIP表示所鉴定的代谢物对两株菌中L-瓜氨酸合成差异的贡献率，并且VIP值越大则表示其与L-瓜氨酸合成的相关程度越大，对 L-瓜氨酸的贡献率也就越大[16]。其中，VIP值大于1的代谢物是影响L-瓜氨酸的积累的关键物质。由图4结果并结合PCA载荷图分析可知，对L-瓜氨酸合成影响最显著的10种生物标志物为葡萄糖、α-酮戊二酸(Akg)、丙酮酸(Pyr)、磷酸、乳酸(Lac)、琥珀酸(Suc)、苹果酸、富马酸、赖氨酸(Lys)和谷氨酸(Glu)。

图3 CIT4与ATCC 13032样品的主成分分析结果Fig.3 Principal component analysis of CIT4 and ATCC13032(a)PCA score plot t[1]-t[2] and(b)PCA derived loading plot p[1]-p[2]

图4 偏最小二乘法( OPLS-DA PLS) 得出的与 L-瓜氨酸含量最相关的胞内代谢物VIP图(置信区间：0.95)Fig.4 Variable importance factor(VIP)plot of the orthogonal to partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA PLS)model generated from the most correlated intracellular metabolites with L-Citrulline (confidence interval:0.95)

2.4 关键代谢物和代谢途径分析

为了进一步探究L-瓜氨酸累积的机制、深入地分析这10种关键的生物标志物与关键代谢途径之间的作用关系，将获得的生物标志物回归到L-瓜氨酸合成代谢网络中，包括中心碳代谢和氨基酸代谢等合成途径，探究限制L-瓜氨酸累积的原因，挖掘2株菌代谢物的不足之处，并以此指导发酵培养基的条件优化，增加L-瓜氨酸的产量。

2.4.1 中心碳代谢

图5为中心碳代谢胞内代谢物相对含量。由图5可知：发酵至24 h后，菌株CIT4中L-瓜氨酸开始累积，此时丙酮酸迅速被利用，其相对含量由24 h的28迅速下降到48 h的7，与此同时，胞内乳酸的相对含量也从35迅速下降到12。而标准菌株ATCC 13032中丙酮酸和乳酸都有一定的累积。这说明CIT4中更多的丙酮酸转化为乙酰CoA，代谢流向主要集中于三羧酸循环(TCA)过程中，而乳酸作为生成L-瓜氨酸的主要副产物，竞争糖酵解途径(EMP)的碳流量。α-酮戊二酸是TCA循环途径中的一个关键节点，是连接碳-氮代谢的关键代谢中间体[17]。在24 ～48 h阶段，L-瓜氨酸大量合成，CIT4中α-酮戊二酸的相对含量由23下降至4，琥珀酸、富马酸以及苹果酸的含量也迅速下降。ATCC 13032中这几种物质含量均比CIT4高，并且呈上升趋势。这表明在CIT4中的α-酮戊二酸更多的用于合成氨基酸代谢的前体物质谷氨酸。ATCC 13032中α-酮戊二酸、柠檬酸、琥珀酸的相对含量较高，说明其TCA循环较为活跃，导制碳源被转化为CO2释放到细胞体外，消耗更多的碳资源。在发酵前期，CIT4 戊糖磷酸途径(HMP)中核糖-5-磷酸和赤藓糖-4-磷酸(E4P)相对含量都要比ATCC 13032菌株高，HMP途径代谢活跃，为L-瓜氨酸合成提供大量的还原力NADPH。而在发酵后期，随着瓜氨酸的积累，细胞停止生长，磷酸戊糖途径的代谢通量大大降低。此结果表明，葡萄糖-6-磷酸分支点周围的磷酸戊糖途径的通量分布随着瓜氨酸产量的增加而降低[18]。

G6P—葡萄糖-6-磷酸;3PG—3-磷酸甘油酸;Ppa—磷酸吡哆醛；X5P—木酮糖-5-磷酸图5 中心碳代谢胞内代谢物相对含量Fig.5 Central carbon metabolism intracellular metabolite relative content

2.4.2 氨基酸代谢

图6为氨基酸代谢胞内代谢物相对含量。由图6可知，CIT4中氨基酸代谢水平整体高于ATCC 13032菌株。谷氨酸作为合成瓜氨酸的前体，其在CIT4菌株中的代谢水平和代谢速率均明显高于ATCC 13032菌株，说明CIT4胞内谷氨酸代谢途径利用比标准菌更加高效。重组菌CIT4在C.glutamicumATCC 13032的基础上为解除反馈阻遏敲除了argR基因，为了截断瓜氨酸利用途径敲除了argG基因。在谷氨酸棒杆菌中N-乙酰谷氨酸激酶(NAGK)作为关键酶受到瓜氨酸的反馈抑制作用，因此构建N-乙酰谷氨酸激酶基因(argB)表达质粒，得到菌株C.glutamicumATCC 13032-ΔargG-ΔargR- pXMJ19-argB(ec)(CIT)。因此，在重组菌CIT4中截断瓜氨酸利用途径，打通合成途径，解除了反馈阻遏作用，实现了L-瓜氨酸的积累，而原始菌C.glutamicumATCC 13032 不能积累L-瓜氨酸。

2.5 代谢轮廓分析指导下的发酵特性理性强化

2.5.1 中心碳代谢途径

以CIT4为实验菌株，在已有的发酵培养基M1中，考察外源添加中心碳代谢前体对L-瓜氨酸产量的影响，结果见图7。由图7可知：添加丙酮酸均可有效提高L-瓜氨酸的累积，在36 h添加1.0 g/L的丙酮酸累积量达到最高，从原来的18.50 g/L提高到19.37 g/L。这是因为丙酮酸的加入使得碳流更多的流向TCA循环，增加了丙酮酸生成乙酰CoA的代谢水平，减少了乙酸和乳酸等副产物的合成，从而提高了α-酮戊二酸的积累量。

在24 h添加1.5 g/L的α-酮戊二酸时，L-瓜氨酸的积累量最高，从原来的18.50 g/L增加到19.53 g/L。这表明外源添加促使更多的碳流经由TCA循环进入谷氨酸和L-瓜氨酸的合成途径，这是因为α-酮戊二酸是TCA循环中一个关键中间物质，它可以生成L-瓜氨酸不可或缺的前体物质谷氨酸。同时也发现，更多的α-酮戊二酸用于合成谷氨酸，使得TCA循环中α-酮戊二酸节点下游的代谢通量持续下降，TCA循环不畅，影响了菌体生长和维持所需的能量和必需物质，菌体生长速率和糖耗速率减慢。

图6 氨基酸代谢胞内代谢物相对含量Fig.6 Amino acid metabolism intracellular metabolite relative content

图7 在CIT4中外源添加中心碳代谢前体对L-瓜氨酸产量的影响Fig.7 Effects of adding precursors of central carbon metabolism on L-citrulline production in CIT4

2.5.2 氨基酸代谢途径

根据对氨基酸代谢途径中关键代谢物的动态监测与分析，为了提高重组菌CIT4 L-瓜氨酸的产量，考察外源添加氨基酸代谢物前体对L-瓜氨酸产量的影响，结果见图8。作为L-瓜氨酸的前体物质，谷氨酸为其提供了第1个氮原子，外源添加谷氨酸对发酵产L-瓜氨酸的有重要影响。由图8可知：谷氨酸的添加使得L-瓜氨酸的积累量有一定的提高，在12 h添加1.0 g/L的谷氨酸时，其产量为19.65 g/L。当谷氨酸质量浓度超过2.0 g/L时，L-瓜氨酸的产量没有明显增加，且菌体生长时间延长，分析其原因可能是谷氨酸含量增加，使得TCA循环中α-酮戊二酸向谷氨酸合成下降，使得TCA循环更为活跃，从而增加菌体的生长。在精氨酸系列氨基酸代谢途径中，鸟氨酸在鸟氨酸氨甲酰磷酸转移酶(OTC，EC 2.1.3.3)催化下合成L-瓜氨酸。

鸟氨酸的加入增强了其与氨甲酰磷酸(Cps)的结合，继而促进L-瓜氨酸的合成。在12 h添加1.0 g/L的鸟氨酸时，L-瓜氨酸的产量为19.57 g/L(图8(b))。

2.5.3 氨甲酰磷酸代谢途径

在氨甲酰磷酸代谢途径中，通过氨甲酰磷酸合成酶(UPS)催化谷氨酰胺、CO2和ATP合成L-瓜氨酸的前体物质氨甲酰磷酸。考察外源添加氨甲酰磷酸代谢前体对L-瓜氨酸产量的影响，结果见图9。由图9可知:外源添加氨甲酰磷酸可以促进鸟氨酸与其结合生成L-瓜氨酸，在24 h添加1.5 g/L的氨甲酰磷酸时，L-瓜氨酸的积累量最高，从原来的18.50提高到19.35 g/L。

L-谷氨酰胺是胞内碳氮代谢的重要节点和重要的氨基供体，能够参与多种细胞生长必需物质的合成[19]。外源添加谷氨酰胺可以增加氨甲酰磷酸代谢的水平，促使合成更多的氨甲酰磷酸，并且可以竞争谷氨酸的代谢通量，减少副产物脯氨酸的生成，为L-瓜氨酸的累积提供更多的氮源，减少了副产物合成途径的代谢流，继而提高L-瓜氨酸的合成。在24 h添加2.0 g/L的谷氨酰胺时，L-瓜氨酸的产量最高，达到19.58 g/L。由此可见，氨甲酰磷酸和谷氨酰胺的加入都有利于细胞的生长，特别是在0 h添加谷氨酰胺时菌体量最大，这可能是因为0 h添加的谷氨酰胺更多的用于细胞的合成代谢和生长。

图8 在CIT4中外源添加氨基酸代谢物前体对L-瓜氨酸产量的影响Fig.8 Effects of adding precursors of amino acid metabolism on L-citrulline production

图9 在CIT4中外源添加氨甲酰磷酸代谢前体对L-瓜氨酸产量的影响Fig.9 Effects of adding precursors of Carbamate phosphate metabolism on L-citrulline production

2.5.4 组合优化培养基发酵产物监测和强化效果验证

在原有的发酵培养基M1基础上，得到总的添加策略及优化操作条件的新型培养基M2：在发酵延迟期(12 h)添加1.0 g/L的谷氨酸和鸟氨酸；在对数初期(24 h)分别添加1.5、1.5和2.0 g/L的α-酮戊二酸、氨甲酰磷酸以及谷氨酰胺。在对数中期(36 h)添加1.0 g/L的丙酮酸，结果见图10。由图10可知：L-瓜氨酸的产量从原来的18.50 g/L增加到20.86 g/L，相比原来增加12.8%。与此同时，还可发现在发酵结束时(60 h)，检测到乳酸、缬氨酸和赖氨酸等副产物的含量也减少，并且菌体生长时间增加。

图10 CIT4在不同培养基(M1 和 M2)条件下 L-瓜氨酸产量的动态变化Fig.10 The dynamic changes of L-citrulline production in CIT4 under M1 and M2 media

3 结论

利用基于GC-MS的代谢组学方法研究了谷氨酸棒杆菌原始菌ATCC 13032和重组菌CIT4胞内代谢轮廓的差异性，从代谢水平系统的分析高产L-瓜氨酸的原因。通过PCA和PLS多元统计分析结果表明:葡萄糖、α-酮戊二酸、丙酮酸、磷酸、乳酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、赖氨酸和谷氨酸这10种代谢物为潜在的生物标志物。同时，从中心碳代谢途径、氨基酸代谢途径和氨甲酰磷酸代谢途径三个方面，定时定量补加不同生物标志物，研究重组菌CIT4发酵过程中L-瓜氨酸的累积量的变化。最终确定组合优化培养基：在重组菌CIT4发酵延迟期(12 h)添加1.0 g/L的谷氨酸和鸟氨酸；在对数初期(24 h)分别添加1.5、1.5和2.0 g/L的α-酮戊二酸、氨甲酰磷酸以及谷氨酰胺；在对数中期(36 h)添加1.0 g/L的丙酮酸，于发酵末期(60 h)产物L-瓜氨酸的产量从原来的18.50 g/L增加到20.86 g/L，相比原来增加12.8%。