D-氨基葡萄糖硫酸盐水解条件的优化及组分分析

姚丽云，高 飞，林进妹，潘裕添

(闽南师范大学 菌物产业工程技术中心,福建 漳州 363000)

甲壳素是一种天然高分子聚合物，是N-乙酰-D-葡萄糖胺的聚糖，属于直链氨基多糖。它也是一种不溶于水、稀碱、稀酸、浓碱及一般有机溶剂，但可以溶于浓HCl、H2SO4和H3PO4；且同时主链可被降解[1]，在浓H2SO4中可以充分水解成易溶于水而微溶于乙醇的白色晶体D-氨基葡萄糖硫酸盐。

氨基葡萄糖类化合物是治疗骨关节炎的特异性药物[2]，在自然界中主要以氨基葡萄糖盐酸盐、氨基葡萄糖硫酸盐和N-乙酰氨基葡萄糖的形式存在。但由于氨基葡萄糖盐酸盐中Cl-浓度高达17%，其细胞毒性相对较大，而氨基葡萄糖硫酸盐由于极易吸潮不稳定，因此，现市面上销售的大多为氨基葡萄糖硫酸盐的复盐，主要是氨基葡萄糖硫酸钠盐、氨基葡萄糖硫酸钾盐。

氨基葡萄糖硫酸盐具有生理活性，是人体关节软骨基质和滑液中蛋白多糖的重要组成部分，可以刺激软骨细胞产生生理性蛋白多糖，促进软骨基质中胶原蛋白的合成，维护关节软骨的形态结构[3]。

目前氨基葡萄糖硫酸盐的制备工艺主要有3种：1)用高浓度盐酸水解甲壳素制备氨基葡萄糖盐酸盐，再与硫酸盐进行复配制备氨基葡萄糖硫酸盐复盐，但是得到的产品Cl-含量较高；2)使用反离子交换法制备氨基葡萄糖硫酸盐，通过这种方法得到的氨基葡萄糖硫酸盐不稳定，难以大量生产；3)用H2SO4直接水解壳聚糖制备氨基葡萄糖硫酸盐，得到的产品稳定性较好。

本文中，笔者以H2SO4水解甲壳素制备氨基葡萄糖硫酸盐，不仅克服了氨基葡萄糖硫酸盐不稳定的特性，相对于氨基葡萄糖硫酸钾盐、氨基葡萄糖硫酸钠盐，用H2SO4水解甲壳素制备的氨基葡萄糖硫酸盐中Cl-含量有望大大降低，可为其应用并开发治疗关节炎的药物提供更优质的原料。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

壳聚糖，100%乙醇，98.08% H2SO4，国药集团化学试剂有限公司；D-氨基葡萄糖硫酸盐(GAH)，上海阿拉丁生化科技有限公司。

1.2 仪器设备

AUY120型电子天平，日本SHIMADZU GORPORATION有限公司；UV-100型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；SHB-III 型循环水式多用真空泵，郑州长城工贸有限公司；JC101型电热鼓风干燥箱，上海成顺仪器有限公司；LG-0.2冻干机，新阳速冻设备制造有限公司；HH2-数显恒温水浴箱，金坛市科析仪器有限公司；RE-301恒温水油浴锅,旋转蒸发器，巩义市予华仪器有限责任公司；METTLER TOLEDO pH计，瑞士METTLER TOLEDO有限公司；Agilent HPLC 1260高效液相色谱仪(HPLC)，美国安捷伦上海科技有限公司；ESI离子源Agilent 6320 Ion Trap LC/MSD，美国安捷伦有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 D-氨基葡萄糖硫酸盐提取工艺流程

准确称取0.5 g壳聚糖粉末，按一定的物料比、温度、H2SO4质量分数和时间冷凝回流提取，弃滤渣定容于100 mL容量瓶中，测定水解后样品中葡萄糖胺的含量；各因素分别做3个平行实验。

1.3.2 单因素实验

分别考察酸解时间、酸解温度、物料比及H2SO4质量分数对D-氨基葡萄糖硫酸盐得率的影响。参照文献[4]中的Elson-Morgan法,以D-氨基葡萄糖硫酸盐(GAH)标准品，计算水解液中氨基葡萄糖硫酸的质量浓度，得到标准曲线(图1)。

标准曲线计算式见式(1)，氨基葡萄糖温度和产率的计算公式见式(2)和(3)。

(1)

(2)

(3)

图1 GAH质量浓度与吸光度值的标准曲线Fig.1 The standard curue of GAH concentration and absorbance value

式中：ρ为测定用样品液中氨基葡萄糖的质量浓度，μg/mL；y为吸光度；a为标准曲线的斜率；b为标准曲线的截距；X为样品中氨基葡萄糖纯度，%；ρ0为试剂空白液中氨基葡萄糖的质量浓度，μg/mL；f为样液稀释倍数；V为样液定容体积，mL；m为试样的质量，g。Z为氨基葡萄糖的产率，%；M为原料的质量，g。

1.3.3 响应面优化实验

根据单因素实验结果，选择酸解温度、H2SO4质量分数、酸解时间和物料比进行四因素三水平优化实验。采用Design-Expert中的Box-Behnken设计响应面实验对提取条件进行优化。以D-氨基葡萄糖硫酸盐得率(Y)为考察目标，H2SO4质量分数(A)、物料比(B)、温度(C)和时间(D)为自变量，因素水平编码见表1。

表1 Box-Behnken设计实验因素水平及编码

1.3.4 验证实验

根据所建立的二次项数学模型预测D-氨基葡萄糖硫酸盐在最优工艺参数下的得率，相同条件下测定D-氨基葡萄糖硫酸盐的实际得率，验证响应面的准确性。

1.3.5 响应面数据统计分析

采用Design-Expert 8.0.6软件分析响应面数据，得出最优工艺参数。

1.3.6 HPLC-MS对酸解组分进行分析[5]

1)色谱条件 色谱柱为StableBond C18分析柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流动相为H3PO4缓冲溶液和乙腈以60∶ 40的体积比混合；流速为0.6 mL/min；检测波长为195 nm；色谱柱柱温30 ℃；进样量20 μL。

2)溶液的配制 ①标准品储备液的配制：精确称取D-氨基葡萄糖硫酸盐标准品110 mg，用去离子水溶解后定容于100 mL容量瓶中，得1.1 mg/mL标准储备液,取待测溶液1 mL经0.22 μm微孔滤膜过滤后，注入高效液相色谱分析。②实验样品溶液的配制：精密称取3份270 mg实验样品于100 mL容量瓶中，用去离子水溶解后定容于100 mL容量瓶中，摇匀。取待测溶液1 mL经0.22 μm微孔滤膜过滤后，注入高效液相色谱分析。③H3PO4缓冲液的配制：将0.5 mL H3PO4溶于水后加水至1 L(用 KOH 溶液调至pH 3.0)，摇匀后用超声波处理15 min，经 0.45 μm滤膜过滤。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 H2SO4质量分数对D-氨基葡萄糖硫酸盐得率的影响

当酸解温度90 ℃，物料比(mL/g)为6∶ 1以及酸解时间4 h时，H2SO4质量分数对D-氨基葡萄糖硫酸盐得率的影响见图1。由图1可知：D-氨基葡萄糖硫酸盐得率随着H2SO4质量分数的升高出现先升高后下降的趋势，当H2SO4质量分数为60%时，D-氨基葡萄糖硫酸盐得率最高。而H2SO4质量分数过高可能引起D-氨基葡萄糖硫酸盐降解炭化。因此选择H2SO4质量分数为60%为宜。

图1 H2SO4质量分数对D-氨基葡萄糖 硫酸盐得率的影响曲线 Fig.1 Effect of sulphuric acid concentration on the yield of D-glucsosamine sulfate

2.1.2 物料比对D-氨基葡萄糖硫酸盐得率的影响

当酸解温度90 ℃、H2SO4质量分数60%以及酸解时间4 h时，物料比对D-氨基葡萄糖硫酸盐得率的影响见图2。由图2可知：D-氨基葡萄糖硫酸盐得率随着物料比的升高出现先升高后下降的趋势，当物料比(mL/g)为6∶ 1时，D-氨基葡萄糖硫酸盐得率最高。因此，选择物料比(mL/g)6∶ 1为宜。

2.1.3 酸解温度对D-氨基葡萄糖硫酸盐得率的影响

当物料比(mL/g)为6∶ 1、H2SO4质量分数60%以及酸解时间4 h时，酸解温度对D-氨基葡萄糖硫酸盐得率的影响见图3。由图3可知：D-氨基葡萄糖硫酸盐得率随着酸解温度的升高出现先升高后下降的趋势；当温度为90 ℃时D-氨基葡萄糖硫酸盐得率最高。因此，选择温度90 ℃为宜。

图2 物料比对D-氨基葡萄糖硫酸盐得率的影响曲线Fig.2 Effect of material ratio on the yield of D-glucosamine sulfate

图3 酸解温度对D-氨基葡萄糖硫酸盐得率的影响曲线Fig.3 Effect of acid hydrolysis temperature on the yield of D-glucosamine sulfate

2.1.4 酸解时间对D-氨基葡萄糖硫酸盐得率的影响

当物料比(mL/g)为6∶ 1、H2SO4质量分数60%以

及酸解温度90 ℃时，酸解时间对D-氨基葡萄糖硫酸盐得率的影响见图4。由图4可知：D-氨基葡萄糖硫酸盐得率呈随着酸解时间的延长出现先升高后下降的趋势，当酸解时间为4 h时，D-氨基葡萄糖硫酸盐得率最高，因此选择酸解时间4 h为宜。

图4 酸解时间对D-氨基葡萄糖硫酸盐得率的影响曲线Fig.4 Effect of acid hydrolysis time on the yield of D-glucosamine sulfate

2.2 响应面法对酸解壳聚糖工艺的优化

2.2.1 响应面设计试验

参照文献[6]的方法，根据单因素得出的最优条件，以H2SO4质量分数、物料比、温度和时间为决策变量，以D-氨基葡萄糖硫酸盐得率为目标函数，应用Box-Behnken设计响应面试验，试验设计及结果见表2。由于单因素得到的最佳温度为90 ℃，在设计响应面时为了使温度与其他3个因素相互影响的曲面图更为显著，故选择以85 ℃为中间点，70 ℃为下限，100 ℃为上限温度。

表2 Box-Behnken试验设计及结果

2.2.2 回归模型的方差分析和显著性检验

回归模型、各项的方差分析和参数估计及显著性分析的结果见表3。

表3 回归模型的方差分析及显著性检验

以D-氨基葡萄糖硫酸盐得率Y为目标函数，得到二次多项回归方程为Y=39.93-2.42A-0.31B+4.05C+2.53D-3.06AB-15.30AC-9.10AD-2.00BC-1.00BD-9.21CD-11.16A2-5.49B2-11.41C2-1.89D2。回归方程F值为83.8，P<0.001，失拟值为5.16，相应的概率P值为0.063 9，大于0.05，显示该模型不失拟，即表示上述回归模型可信，F值越大，说明该因素对D-氨基葡萄糖硫酸盐得率影响越大。由表3可以看出：影响D-氨基葡萄糖硫酸盐得率的因素主次顺序为温度、时间、H2SO4质量分数、物料比，一次项C项偏回归系数极显著，A、D两项偏回归系数较显著，B项偏回归系数不显著。说明温度、时间和H2SO4质量分数对D-氨基葡萄糖硫酸盐得率影响较大，物料比的影响较小，交互项只有AC、AD、CD有显著性，二次项中 A2、B2和C2的偏回归系数达极显著，表明影响因素对D-氨基葡萄糖硫酸盐得率并非呈简单的线性关系。

由图5～10可以看出：响应面均开口向下，都从最高点向四周边缘逐渐下降，图7曲面最陡、等值线最高，即H2SO4质量分数与温度2个因素的交互影响最大，图6、图10曲面较陡，等值线均是扁的，表明时间与H2SO4质量分数、温度这2个因素的交互影响较大。图5与图8曲面较平，等值线都较圆，表明物料比与酸解时间、温度这2个因素的交互影响较小。结合回归模型，由Design-Expert对回归方程进行分析可得出：提取D-氨基葡萄糖硫酸盐的最佳工艺为H2SO4质量分数53.29%、物料比(mL/g)为6∶ 1、温度88.31 ℃和时间6 h，理论得率为43.86%。为了验证回归模型的有效性，用响应面的最优条件水解虾蟹壳壳聚糖30 g，测定氨基葡萄糖含量，换算成D-氨基葡萄糖硫酸盐得率，重复3次实验，得到的实际产率为42.69%，与理论值并无显著差异，由此证明实验模型合理。

2.3 HPLC-MS对H2SO4水解壳聚糖产物组分的分析

D-氨基葡萄糖硫酸盐标准品质谱图如图12(a)所示，低质谱区出现离子丰度较大的质荷比(m/z)=162.0,推测为D-氨基葡萄糖硫酸盐(GHS)失去1个NH2H2SO4的[M- NH2H2SO4]碎片离子，m/z=180推测为GHS失去1个H2SO4再加上1个H+的[M- H2SO4+H+],m/z=201.9推测为GHS失去1个NH2H2SO4再加上1个K+的[M- NH2H2SO4+K+]碎片离子，结果与文献[7]对GHS分子质量的记载一致。

图5 酸解时间与物料比对D-氨基葡萄糖硫酸盐 得率影响的响应面曲线Fig.5 Response surface plot of time and the ratio of liquid to solid to the yeild

图6 H2SO4质量分数与时间对D-氨基葡萄糖 硫酸盐得率影响的响应面曲线Fig.6 Response surface plot of sulphuric acid concentration and time to the yield

图7 H2SO4质量分数与温度对D-氨基葡萄糖 硫酸盐得率影响的响应面曲线Fig.7 Response surface plot of sulphuric acid concentration and temperature to the yield

图8 物料比与温度对D-氨基葡萄糖 硫酸盐得率影响的响应面曲线Fig.8 Response surface plot of the ratio of liquid to solid and temperature to the yield

图9 H2SO4质量分数与物料比对D-氨基葡萄糖 硫酸盐得率影响的响应面曲线Fig.9 Response surface plot of ratio of the liquid to solid and sulphuric acid concentration to the yield

图10 时间与温度对D-氨基葡萄糖 硫酸盐得率影响的响应面曲线Fig.10 Response surface plot of time and temperature to the yield

H2SO4水解壳聚糖制备的D-氨基葡萄糖硫酸盐样品m/z谱图如图12(b)所示。低质谱区出现离子丰度较大的m/z=162.0推测为GHS失去1个NH2H2SO4的[M- NH2H2SO4]碎片离子，m/z=180推测为GHS失去1个H2SO4再加上1个H+的[M- H2SO4+H+],m/z=202.1推测为GHS失去1个NH2H2SO4再加上1个K+的[M- NH2H2SO4+K+]碎片离子，m/z=321.1推测为葡萄糖胺二聚糖硫酸盐失去1个NH2H2SO4的碎片离子。

故综合图11和12液相谱图与质谱图推测：H2SO4水解壳聚糖的产物为D-氨基葡萄糖硫酸盐、葡萄糖胺和葡萄糖胺二聚糖硫酸盐混合物。

注：(a)对照品溶液为HPLC-UV在195 nm的色谱图图11 对照品溶液和样品溶液的 HPLC-UV谱图Fig.11 HPLC-UV chromatograms of refence substance CK and sample

图12 对照品溶液和样品溶液的一级质谱图Fig.12 MS and MS/MS spectra of CK and sample

3 结论

通过响应面法得出提取D-氨基葡萄糖硫酸盐的最佳工艺：H2SO4质量分数53.29%，物料比(mL/g)为6∶ 1，温度88.31 ℃ 和时间6 h，得到理论产率43.86%。水解产物为D-氨基葡萄糖硫酸盐、葡萄糖胺和葡萄糖胺二聚糖硫酸盐混合物。该混合物稳定性较好，克服了氨基葡萄糖硫酸盐不稳定的特性，为其进一步被应用于开发治疗关节炎的用药提供了依据。