北海沙蟹特征滋味成分的分析

刘天天，梁中永，范思华，夏 宁，陈德慰*

（广西大学轻工与食品工程学院，广西 南宁 530004）

沙蟹（Mictyris brevidactylus）又名兵蟹，属软甲纲、十足目、和尚蟹科[1]，主要分布在印度洋与太平洋的潮间带及潮上带区域[2]，在我国主要分布在广东和广西的沿海地带，其中广西防城港市和北海市是沙蟹的主要产地。目前，沙蟹仍然属于捕捞产品，并未有人工养殖。在我国广西北海市，当地人们将捕获的沙蟹经过腌制发酵之后，制成具体独特风味的调味汁——沙蟹汁，沙蟹汁自身浓郁鲜香，同时也能赋予其他食材独特的鲜味。因此，沙蟹是当地一种独具特色的食品资源。

从味觉的角度而言，咸味、酸味、甜味和苦味被认为是食品的4 种基本味道。然而，起源于东方的“鲜味”由于其独特的呈味物质与其他味感物质相互作用时，使得食品的整体风味更加鲜美，所以欧美各国乃至全世界认为鲜味是继咸味、酸味、甜味以及苦味之后的第5种基本味道，并于1908年首次鉴别，于1985年第一届国际学术研讨会中正式引进为一种基本味道[3-4]。蟹肉中由于富含谷氨酸、天冬氨酸、5’-单磷酸腺苷二钠（adenosine monophosphate，AMP）以及5’-单磷酸肌苷二钠（inosine monophosphate，IMP）等呈鲜的化合物而表现出强烈的鲜味，因此鲜味是其最重要的特征滋味[5-6]。研究表明呈味核苷酸会与某些游离氨基酸之间存在协同增鲜作用，如与谷氨酸之间的协同作用会产生更加强烈的鲜味[7-8]。甜味也是蟹肉的一个主要呈味特征，特别是新鲜的蟹肉中含有一种天然并且舒适的甜味，这主要是由于其富含甘氨酸和丙氨酸的缘故，它们具有令人愉快的甜味，并且具有含量高和甜度大的特点[9]，对蟹肉的呈味具有重要贡献。酸味对动物类的肉风味具有重要贡献，但是在鲜活水产品中通常无法感受到酸味，这是由于新鲜水产品的肌肉组织一般呈现微碱性。研究表明，大闸蟹肌肉组织中的有机酸含量很低，因此有机酸对大闸蟹的呈味并没有直接的作用[6]。虽然蟹肉中含有如疏水性的氨基酸、疏水性的小分子肽等具有苦味的物质，但是在鲜活蟹肉中通常也无法感受到苦味，这是由于食品中的不同物质具有相互抑制或者协同的作用，蟹肉中这些具有苦味的物质能够赋予蟹肉适宜的整体风味。咸味主要是由一些无机盐所贡献，一些研究表明无机盐并不是水产品滋味的直接贡献者，但是对于滋味的整体性有着修饰的作用，是一种呈味辅助物[10]。

由于沙蟹的利用及开放程度还相当低，就目前所了解的，国内外对其利用的报道也较少，目前仅有从其蟹壳中提取壳聚糖的研究。本实验研究了沙蟹的非挥发性滋味物质，并采用味道强度值（taste activity value，TAV）确定其中主要的呈味物质及贡献，最后通过味精当量（equivalent umami concentration，EUC）分析鲜味氨基酸和呈味核苷酸之间的协同作用，并对其鲜味进行评价，旨在为沙蟹的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活沙蟹购买于广西北海市，单个质量为3～5 g，直径30～40 mm。

17 种氨基酸混和标准品 美国Sigma公司；有机酸混和标准品、AMP标准品、5’-单磷酸鸟苷二钠（guanosine monophosphate，GMP）标准品、IMP标准品 上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯） 天津光复精细化工研究所；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

SKD-800型自动凯氏定氮仪 上海沛欧分析仪器有限公司；7890B气相色谱仪、5977A质谱仪、7700e电感耦合等离子体原子发射光谱仪 安捷伦科技（美国）有限公司；L8900型全自动氨基酸分析仪 日本Hitachi公司；e2695高效液相色谱仪 沃特世科技（上海）有限公司；5810R型冷冻离心机 艾本德中国有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

将鲜活沙蟹样品在冰鲜条件下运至实验室，立即清洗干净，然后做以下处理：仔细去除沙蟹的肠子，保留其他部位，在冰浴条件下均质，然后真空包装，并置于-20 ℃冰箱冷冻室内保存备用。

1.3.2 基本成分的测定

水分含量：参考GB/T 5009.3—2010《食品中水分的测定》[11]，采用直接干燥法，105 ℃干燥至恒质量。蛋白质含量：参考GB/T 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》[12]凯氏定氮法。粗脂肪含量：参考GB/T 14772—2008《食品中粗脂肪的测定》[13]索式抽提法。灰分含量：参考GB/T 5009.4—2010《食品中灰分的测定》[14]，高温灼烧法，550 ℃灼烧至恒质量。

1.3.3 游离氨基酸的分析

样品预处理的方法参考付娜等[15]的方法并作适当修改：准确称取样品5.00 g，然后加入20 mL4 ℃的5%三氯乙酸溶液于冰浴条件下匀浆，最后用4 ℃的5%三氯乙酸溶液定容至25 mL，并于4 ℃条件下静置24 h。次日用定性滤纸过滤，收集滤液并吸取1 mL于4 ℃条件下以10 000 r/min离心15 min，然后将上清液转移至衍生管中进行柱前衍生化反应，衍生方法采用OPA-FMOC法，过膜后使用全自动氨基酸分析仪进行氨基酸分析。

1.3.4 呈味核苷酸的分析

样品的提取与分析方法参考Chen Dewei等[6]的方法并作适当修改：准确称取5.00 g样品，然后加入20 mL4 ℃的5%高氯酸溶液于冰浴条件下匀浆，以5 000 r/min离心15 min，吸取上清液，再用10 mL高氯酸溶液对沉淀物进行重提2 次，合并3 次上清液，用5 mol/L氢氧化钠溶液调节pH 6.5，用超纯水定容至100 mL。过膜后进行高效液相色谱分析。

高效液相色谱分析条件：Waters E2695高效液相色谱仪，色谱柱：Agilent TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温30 ℃；流动相A：0.05%磷酸溶液，流动相B：甲醇（色谱纯）；采用梯度洗脱，洗脱程序为0～10 min，95% A～85% A；10～15 min，85% A～30% A；15～21 min，30% A～95% A。进样量：10 μL。检测器：Waters 2998紫外检测器，检测波长为260 nm。

1.3.5 有机酸的分析

有机酸的前处理与分析方法参考Chen Dewei等[6]的方法并作适当修改。

样品预处理：准确称取5.00 g样品，然后加入25 mL蒸馏水匀浆2 min，然后在10 000 r/min条件下离心25 min。取上清液过膜后进行高效液相色谱分析。

高效液相色谱分析条件：Waters E2695，色谱柱：Agilent TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；流动相A：0.05%磷酸溶液，流动相B：甲醇（色谱纯）；采用梯度洗脱，洗脱程序为0～10.0 min，95% A～85% A；10～15 min，85% A～30% A；15～21 min，30% A～95% A。进样量：10 μL。检测器：Waters 2998紫外检测器，检测波长为215 nm。

1.3.6 无机离子的测定

K+、Na+含量的测定方法采用电感耦合等离子体原子发射光谱测定方法[16]。PO43-测定参考GB/T 5009.87—2003《食品中磷的测定》[17]。Cl-的测定参考GB/T 12457—2003《食品中氯化钠的测定》[18]。

1.3.7 甜菜碱的测定

本实验采用乙醇提取法提取甜菜碱，并用比色法测定其含量。甜菜碱的提取方法及比色方法参考黄丽贞[19]的方法并作适当修改：准确称取沙蟹样品25 g，加入40 mL蒸馏水匀浆2 min，高压蒸煮，冷却后加入95%乙醇溶液150 mL，搅拌均匀后于4 ℃静置过夜。次日，以8 000 r/min转速离心10 min，收集上清液，再用95%乙醇溶液对沉淀物进行重提2 次，合并3 次上清液，用超纯水定容至50 mL，即为样品制备液，于4 ℃冰箱冷藏备用。取样品制备液5 mL，用冰水浴冷却15 min，再用浓盐酸调节pH 1.0，然后滴加2%雷氏盐溶液5 mL，充分混匀后放回冰水浴，保持温度为1～4 ℃静置3 h。然后在低温环境下真空抽滤，用无水乙醚洗涤结晶至溶液无色，再用70%丙酮溶液溶解甜菜碱雷氏盐结晶于25 mL比色管中并定容，使用722型分光光度计测定525 nm波长处吸光度，以试剂空白作为对照测定吸光度。标准曲线的制作参考苏键等[20]方法。

1.3.8 氧化三甲胺的测定

本实验采用乙醇提取法提取氧化三甲胺，并用比色法测定其含量。氧化三甲胺的提取方法参考黄丽贞[19]的方法并作适当修改：准确称取沙蟹样品25 g，加入40 mL蒸馏水匀浆2 min，高压蒸煮，冷却后加入95%乙醇150 mL，搅拌均匀后于4 ℃静置过夜。次日，以8 000 r/min转速离心10 min，收集上清液，再用95%乙醇对沉淀物进行重提2 次，合并3 次上清液，用超纯水定容至50 mL，即为样品制备液，于4 ℃冰箱冷藏备用。

氧化三甲胺的测定方法参考卜俊芝[10]的方法并作适当修改：利用Fe2+-EDTA试剂将待测样品中的氧化三甲胺还原成三甲胺，待测样品中的氧化三甲胺的含量为还原后的三甲胺含量减去还原前的三甲胺含量。

1.3.9 TAV的测定

评价单个滋味物质对食品滋味的贡献大小通常采用TAV，这是一种比较客观的评价方法，目前已经广泛应用于各种食品的风味研究[21]。计算公式如式（1）所示：

当TAV大于1时，说明该物质对食品的风味有贡献，贡献程度与其数值大小成正比；当TAV小于1时，则说明该物质对于食品的风味没有贡献。

1.3.10 EUC的测定

由于鲜味氨基酸（如Glu或Asp）与呈味核苷酸（如5’-IMP、5’-GMP或5’-AMP等）具有协同作用，能增强鲜味[22]。通常采用EUC评价二者的协同增鲜作用，即100 g二者协同增鲜作用产生的鲜味强度相当于多少克的谷氨酸钠（monosodium glutamate，MSG）所产生的鲜味强度，单位表示为g/100 g。其计算见式（2）：

式中：ap为Glu或Asp质量分数/%；bp为Glu或Asp相当于MSG的相对鲜度系数（Glu=1；Asp=0.077）；aq为5’-IMP、5’-GMP或5’-AMP质量分数/%；bq为5’-IMP、5’-GMP或5’-AMP相当于MSG的相对鲜度系数（5’-IMP=1，5’-GMP=2.3，5’-AMP=0.18）。

1.4 数据处理

所有的实验重复测定3 次，取其平均值；使用SPSS 19.0进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 沙蟹样品的基本成分

表1 沙蟹蟹肉的基本组成（以湿质量计）Table1 Proximate composition of soldier crab

由表1可知，蛋白质是沙蟹的主要成分，灰分含量也较高，但是粗脂肪含量比较低。沙蟹的水分质量分数为75%左右，这与已经报道的海蟹以及其他甲壳类水产品的水分含量大致相似，蜘蛛蟹的水分质量分数为79%[23]，中华绒螯蟹的水分质量分数为78%[24]。沙蟹的蛋白质质量分数为11.4%，这与其他蟹类如蜘蛛蟹（14.5%）[23]、蓝蟹（16%）[25]、青蟹（17%）[26]和中华绒螯蟹（19%）[24]等相比，沙蟹的蛋白质含量略低，这可能与其自身的结构有关——沙蟹的含肉量较低；另外与其摄食习惯以及生长环境也有一定的关系。沙蟹的粗脂肪质量分数为1.1%左右，其含量介于一般甲壳类产品（0.5%～1.5%）之间[23,27-28]，其粗脂肪主要是存在于性腺以及内脏中。由于沙蟹的自身结构较小（单个质量为3～5 g；直径30～40 mm）以及当地人民对于沙蟹的食用习惯，因此在预处理中，保留了沙蟹的部分蟹壳以及蟹爪，因此造成沙蟹样品的灰分含量大约是其他蟹类的6～8倍[23-24]，蟹壳和蟹爪含有大量的碳酸盐（如碳酸钙和碳酸镁等），从而增加了灰分的含量，同时从另一个角度来说，沙蟹也是一种钙含量丰富的食物源。

2.2 沙蟹样品中游离氨基酸结果分析

表2 游离氨基酸含量、味道特征、呈味阈值及TAVTable2 The contents, taste attributes, tastes threshold and TAV of free amino acids in crab meat

由表2可知，沙蟹的游离氨基酸总含量为1 620 mg/100 g，精氨酸（655.5 mg/100 g）、甘氨酸（423.9 mg/100 g）、脯氨酸（111.8 mg/100 g）、组氨酸（105.1 mg/100 g）和丙氨酸（90.9 mg/100 g）这5 种氨基酸的含量较高，它们五者之和占了总游离氨基酸的85%以上。苯丙氨酸和酪氨酸等游离芳香族氨基酸的含量较低。这一结果与中华绒螯蟹[6,29]和雪蟹[30]的游离氨基酸组成特点相一致。

人类对味道的感知不仅仅与呈味物质的含量高低有关，还与该呈味物质的呈味阈值有关，即呈味物质的含量与其呈味阈值共同决定了人类对于味道的感知。由沙蟹中各个游离氨基酸的含量及相应的呈味阈值，根据公式（1）计算出各游离氨基酸的TAV，结果如表2所示。精氨酸的TAV最高，为13.11，因此它是沙蟹滋味的主要贡献者。之前的研究显示，精氨酸大量存在于海产品中，被认为是海产品中重要的风味物质之一，虽然精氨酸本身具有苦味，但是它能赋予海产品特有的适宜滋味[31]。甜味氨基酸（如甘氨酸和丙氨酸）同样具有较高的TAV，它们的TAV分别是3.26和1.52，因此它们对沙蟹的滋味具有重要贡献，赋予了沙蟹特有的甘甜味。尽管游离的谷氨酸含量较低，其TAV为1.42，但对于沙蟹的鲜味有着重要的贡献。值得注意的是，沙蟹样品中具有苦味组氨酸也具有很高的TAV，这一结果与中华绒螯蟹有着明显不同，据Chen Dewei等[6]的报道，中华绒螯蟹中游离组氨酸的TAV仅为0.3；而三疣梭子蟹和细点圆趾蟹中游离组氨酸的TAV也较高，它们的TAV分别为4.3和4.2[10]。因此组氨酸可能对海蟹的特征滋味有着重要作用。综上所述，精氨酸、组氨酸、甘氨酸、丙氨酸以及谷氨酸这5 种氨基酸是沙蟹滋味的主要贡献者。其他的游离氨基酸由于其含量低于相应的呈味阈值，因此TAV也小于1，这些游离的氨基酸对沙蟹的滋味没有直接的影响。

2.3 沙蟹样品中呈味核苷酸结果分析

由表3可以看到，沙蟹中IMP是含量最高的呈味核苷酸，其含量为80.3 mg/100 g；其次是AMP和GMP，含量分别为38.4 mg/100 g和29.1 mg/100 g。

IMP具有强烈的鲜味，它的鲜味强度高于MSG，样品的IMP含量最高从另一方面也说明了所用实验原料的新鲜程度较高。GMP同样具有强烈的鲜味，它的鲜味强度大约是IMP的2.3 倍。AMP的呈味特点与其含量有关，当含量低于100 mg/100 g时具有甜味的特点，当含量高于100 mg/100 g时，其甜味减弱，而鲜味增强[6]。这些呈味核苷酸不仅本身带有鲜味，还能与MSG、游离氨基酸以及无机离子等产生协同增鲜作用，显著提高水产品的鲜味。

3 种呈味核苷酸的TAV由高到低依次为IMP（3.2）、GMP（2.3）、AMP（0.8），由此可以得到以下结论：IMP和GMP是沙蟹鲜美的主要原因，而AMP并不是沙蟹滋味的主要贡献者。

2.4 氨基酸与核苷酸的协同增鲜作用

EUC可以直观地表达鲜味氨基酸与呈味核苷酸之间的协同增鲜作用，目前已经广泛的用于分析食品的鲜味[32-33]。根据公式（2）计算结果如表4所示，沙蟹样品EUC为6.4 g/100 g，也就是每100 g样品（以湿质量计）所具有的鲜味强度大约相当于6.4 g MSG所产生的鲜味。MSG的呈味阈值为0.03 g/100 mL，因此沙蟹EUC的TAV高达213，这也就是沙蟹具有强烈鲜味的原因。对比之前的研究，沙蟹的EUC大约是中华绒螯蟹的1.5 倍[6]，是雪蟹的12 倍[34]，因此沙蟹的鲜味强度高于中华绒螯蟹和雪蟹，这主要得益于沙蟹样品中谷氨酸、IMP以及GMP的含量较高。

表4 沙蟹蟹肉的EUC（以湿质量计）Table4 EUC of soldier crab (on a wet matter basis)

2.5 沙蟹样品中有机酸分析

有机酸如乳酸、乙酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸等也是水产品中重要的呈味物质之一。有机酸主要呈现酸味，但是琥珀酸及其钠盐具有鲜味，并能具有和谷氨酸类似的增强鲜味的特性。

表5 有机酸含量、味道特征、呈味阈值及TAVTable5 The contents, taste attributes, tastes threshold and TAV of organic acids in crab meat

从表5可以看出，在沙蟹中仅检测到乳酸和琥珀酸，其他有机酸并未检测到。乳酸和琥珀酸是虾蟹等甲壳纲动物肌肉中的主要代谢产物，在之前的报道中认为这2 种有机酸对于鲜味和海产品的特征滋味有一定的贡献[35]。样品中的乳酸和琥珀酸的TAV分别是0.35和0.83，均小于1，因此它们对于蟹肉的滋味并没有直接的作用，这与Hayashi等[36]对5 种蟹中有机酸的分析结果相似，说明有机酸对沙蟹的呈味仅起到辅助作用，并不是呈味的直接贡献者。

2.6 沙蟹样品中无机离子结果分析

表6 无机离子含量、味道阈值及TAV Table6 The contents, tastes threshold and TAV of inorganic ions in crab meat

由表6可知，Na+的TAV为1.7，除Na+以外，其他3 种无机离子的TAV均小于1，因此Na+是蟹肉滋味的直接贡献者，其他3 种无机离子对沙蟹的滋味没有直接的贡献作用。之前的研究表明：虽然无机离子本身主要提供咸味和苦味，但是它却对鱼类和贝类等水产品风味的形成具有辅助作用，因此被认为是水产品中不可缺少的呈味辅助物和鲜味增强物[37]]。

2.7 甜菜碱和氧化三甲胺分析

甜菜碱和氧化三甲胺广泛存在于虾蟹等甲壳类水产品中，是水产品中主要的呈味物质之一，对水产品的风味具有一定的影响。其中甜菜碱，主要是甘氨酸甜菜碱具有爽口的甜味，对鲜味也有一定的贡献，同时可以增强厚味[38]；氧化三甲胺具有特殊的海鲜味，因此它是水产品中海腥味的主要来源[39]。

沙蟹中甜菜碱的含量为（267.4±2.1）mg/100 g，其含量显著高于青蟹（189.4 mg/100 g）、河蟹（45.2 mg/100 g）[40]和中国对虾（64.7 mg/100 g）[41]，低于三疣梭子蟹（3 937.3 mg/100 g）和细点圆趾蟹（4 603.5 mg/100 g）[10]。有研究指出，甜菜碱在生物体内含量的高低与其生长阶段有关[42]。甜菜碱的呈味阈值大约为250～500 mg/mL[28]，由于其阈值较高，因此甜菜碱对于沙蟹的滋味并没有直接的作用。

沙蟹样品中氧化三甲胺的含量为（428.1±0.3）mg/100 g，远高于其他水产品，如罗氏沼虾（1.51 mg/100 g）[43]和三疣梭子蟹（254.9 mg/100 g）[10]等。由于氧化三甲胺在沙蟹中的含量较高，因此它对沙蟹的特征滋味有一定的作用。

3 结 论

本实验首先研究北海沙蟹的基本营养成分，然后系统分析沙蟹样品的非挥发性滋味物质，包括游离氨基酸、5’-呈味核苷酸、有机酸以及无机离子等呈味物质，并采用TAV确定其中主要的呈味物质及贡献，最后通过EUC分析鲜味氨基酸和呈味核苷酸之间的协同作用，并对其鲜味进行评价。结果显示沙蟹样品的蛋白质含量适中，脂肪含量低，是一种理想的食物源；沙蟹样品的游离氨基酸总量为1 620 mg/100 g，其中TAV大于1的呈味氨基酸为精氨酸（13.11）、组氨酸（5.25）、甘氨酸（3.26）、丙氨酸（1.52）和谷氨酸（1.42），这5 种呈味氨基酸对蟹肉的滋味有着重要贡献；蟹肉样品中含量最高的呈味核苷酸是IMP（80.3 mg/100 g），其次是AMP（38.4 mg/100 g）和GMP（29.1 mg/100 g），其中IMP和GMP的TAV大于1，因此它们是蟹肉鲜味的主要贡献者；无机离子中Na+的TAV大于1，因此它对蟹肉的滋味有一定的影响；蟹肉的EUC值以MSG质量计，为6.4 g/100 g，从而解释了沙蟹蟹肉具有强烈鲜味的原因。综上所述，沙蟹不仅是具有一定的营养价值，同时拥有独特的鲜味成分组成，是鲜味食品的代表，本实验的研究结果也为沙蟹的开发和利用提供一定的参考价值。