微波辅助提取毛头鬼伞多糖及其抗氧化性测定

周林宗，徐文博，杨申明*

(1.楚雄师范学院 地理科学与旅游管理学院，云南 楚雄 675000；2.楚雄师范学院 化学与生命科学学院，云南 楚雄 675000)

毛头鬼伞(Copyinds comatus)别名毛鬼伞、鸡腿蘑、刺蘑菇，它属鬼伞科(Coprinaceae)、鬼伞属(Coprinus)，是一种分布较广的食用菌，它属大型真菌[1]。在我国各省区均有种植，菇体白色，单生或丛生，未开伞前状如鸡腿，又称其为"刺蘑菇"，它的子实体富含蛋白质、多糖、脂肪、维生素和微量元素，具有较高的营养和药用价值[2-3]。但目前对毛头鬼伞多糖的提取及抗氧化性的研究报道相对较少，本研究采用微波辅助法从毛头鬼伞中提取多糖，通过单因素实验优化微波辅助提取毛头鬼伞菇多糖的提取条件，并就所提取的毛头鬼伞多糖对1,1-苯基-2-苦肼基(DPPH)自由基和羟基自由基的清除作用进行初步研究，以期为毛头鬼伞多糖的综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

毛头鬼伞，采于云南省楚雄市，经鉴定为鬼伞属鬼伞科毛头鬼伞(Copyinds comatus)；葡萄糖标准品(纯度≥98%)，其他所用化学试剂均为国产分析纯，水为实验室自制超纯水。

1.1.2 仪器与设备

UV-2100型紫外可见分光光度计，G80F23CN3P-Q5型微波炉，CP214C型电子天平，HH-2型恒温水浴锅，SHZ-ⅢA型循环水式真空泵，202-00型电执鼓风干燥箱。

1.2 方法

1.2.1 供试材料的处理

将新鲜的毛头鬼伞用超纯水洗净、切片风干后，放入55 ℃烘箱中烘干，粉碎后过40目筛，得毛头鬼伞干粉。再将毛头鬼伞干粉用滤纸包好放入索氏提取中，加入石油醚(沸程30～60 ℃)冷浸36 h，然后将其置于水浴中回流提取，直到除去样品中脂溶性色素后，取出样品风干至石油醚全部挥发，再将毛头鬼伞干粉放入55 ℃烘箱中烘干，得去除色素的毛头鬼伞干粉，备用。

1.2.2 多糖含量的测定

用葡萄糖作为标准品，参考文献[4]的方法，采用苯酚浓硫酸法测定毛头鬼伞多糖的含量。所得线性回归方程A=38.17274C-0.0013，相关系数R=0.9994。结果表明吸光度与葡萄糖质量浓度具有良好的线性关系，因此，可用于毛头鬼伞多糖含量测定。

多糖提取率(%)=C×N×V/M×100%

式中：C为根据回归方程计算出的多糖浓度(mg/mL)；V为定容体积(mL)；N为稀释倍数；M为去除色素的毛头鬼伞样品质量(g)。

1.2.3 提取工艺单因素实验

1.2.3.1料液比对毛头鬼伞多糖提取率影响

准确称取5份1.0000 g去除色素的毛头鬼伞粉末样品，分别置于100 mL锥形瓶中，加20、30、40、50、60 mL蒸馏水，将样品置于微波炉中，在600W功率下处理60 s。提取完毕后冷却抽滤。将滤液转移至100 mL容量瓶中定容，再精确移取溶液10 mL于50 mL容量瓶中定容。移取0.10 mL试液于10 mL比色管中，加1 mL 5%苯酚溶液，再加入5 mL浓硫酸边加边振荡，放置10 min；在40℃水浴中显色20 s，放置10min冷却，在490 nm波长处，以试剂空白作参比测定吸光度，计算提取率。

1.2.3.2微波功率对毛头鬼伞多糖提取的影响

准确称取5份1.0000 g去除色素的毛头鬼伞粉末样品，分别置于100 mL锥形瓶中，加入40 mL蒸馏水，将样品置于微波炉中，分别在200、400、600、800、1000 W功率下处理60 s。其他操作同1.2.3.1节，计算提取率。

1.2.3.3微波辐射时间对毛头鬼伞多糖的提取影响

准确称取5份1.0000 g去除色素的毛头鬼伞粉末样品，分别置100 mL锥形瓶中，加入40 mL蒸馏水，将样品置于微波炉中，在600 W功率下分别处理20、30、40、50、60 s。其他操作同1.2.3.1节，计算提取率。

1.2.4 加样回收率测定

取1.0 mL已测得毛头鬼伞多糖提取率的样品溶液，分别加入质量浓度为0.1000 mg/mL葡萄糖对照液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，按标准曲线绘制方法测定吸光度，计算回收率。

1.2.5 毛头鬼伞多糖含量的测定

准确称取3份1.0000 g去除色素的毛头鬼伞样品，在料液比1∶40(g/mL)、微波功率600 W下分别提取60 s。其他操作同1.2.3.1节，计算平均提取率。

1.2.6 毛头鬼伞多糖抗氧化性的测定

将微波辅助提取得到的毛头鬼伞多糖溶液分别配制成0.004、0.008、0.012、0.016、0.020 mg/mL 5种质量浓度，研究其抗氧化性。

1.2.6.1清除DPPH·能力测定

参照文献[5]的方法测定毛头鬼伞多糖溶液对DPPH·的清除能力。毛头鬼伞多糖对DPPH·清除率计算公式为：

式中：Ac为不加毛头鬼伞多糖溶液空白对照的吸光度；Ai为DPPH溶液加毛头鬼伞多糖溶液的吸光度；Ab为无水乙醇加毛头鬼伞多糖溶液的吸光度。

1.2.6.2清除·OH能力测定

参照文献[6]的方法测定毛头鬼伞多糖对·OH的清除能力。毛头鬼伞多糖对·OH清除率计算公式为：

式中：A0为毛头鬼伞多糖溶液的空白对照溶液的吸光度；AX为加过氧化氢毛头鬼伞多糖溶液的吸光度；AX0为不加过氧化氢毛头鬼伞多糖溶液的吸光度。

2 结果与分析

2.1 提取工艺单因素试验结果

2.1.1 料液比对毛头鬼伞多糖提取影响

在微波功率600 W，微波时间60 s的条件下，考察料液比对毛头鬼伞多糖提取效果的影响，结果见图1。从图1可以看出，料液比为1∶20～1∶40(g/mL)时，毛头鬼伞多糖提取率随提取溶剂用量的增大而增大，当液料比增大到1∶40(g/mL)时，提取率达到最大为5.39 %；之后随提取溶剂用量的继续增大，毛头鬼伞多糖提取率下降。这可能是溶剂用量影响有效成分浸出溶液的浓度差，从而影响原料内部与外部之间提取成分的传质过程。在液料比较小时，短时间内多糖的溶出就达到平衡，不利于多糖的进一步溶出，但液料比太大受溶解度的作用变小，且溶剂用量过多导致后续蒸发困难，而底物浓度过低使得提取得率呈现下降趋势[7]。因此，确定适宜的料液比为1∶40(g/mL)。

图1 液料比对毛头鬼伞多糖提取效果的影响

2.1.2 微波功率对毛头鬼伞多糖提取效果的影响

在料液比1∶40(g/mL)，微波时间60 s的条件下，考察微波功率对毛头鬼伞多糖提取效果的影响，结果见图2。从图2可以看出，微波功率为200～600 W时，毛头鬼伞多糖提取率随微波功率的增大而增大，当微波功率增大到600 W时，提取率达到最大为5.37%；之后随微波功率的继续增大，毛头鬼伞多糖提取率下降。出现这种趋势的原因可能是当微波时间一定时，微波功率升高，物料吸收的微波热能随之增加，有效促进植物细胞的破碎，溶出物质增加；当微波功率增加达到一定水平后，会引起多糖降解，多糖提取率反而减小[8]。因此，确定适宜的微波功率600 W。

图2 微波功率对毛头鬼伞多糖提取效果的影响

2.1.3 微波时间对毛头鬼伞多糖提取效果的影响

在料液比1∶40(g/mL)，微波功率600 W的条件下，考察微波时间对毛头鬼伞多糖提取效果的影响，结果见图3。从图3可以看出，当微波时间为40～60min时，毛头鬼伞多糖的提取率随微波时间的延长而增大，当微波时间延长到60min时，提取率达到最大为5.41 %；之后随微波提取时间的继续延长，毛头鬼伞多糖的提取率逐渐减小。出现这种趋势的原因可能是在较短的时间内微波对毛头鬼伞细胞壁及细胞膜的破坏作用大，导致细胞物质大量溶出，提取率显著提高；另一方面随着微波时间的延长，细胞中其他杂质的溶出增加，使得多糖得率下降[9]。因此，确定适宜的微波提取时间60min。

图3 微波时间对毛头鬼伞多糖提取效果的影响

2.2 多糖平均提取率及回收率的测定结果

根据单因素实验所确定的提取工艺条件对毛头鬼伞中的多糖进行提取，并对其平均提取率及回收率进行测定。结果毛头鬼伞多糖的平均提取率为5.40%，平均加样回收率为98.76%，RSD值为0.73%，表明本实验方法对毛头鬼伞多糖提取率测量的准确度较高。

2.3 毛头鬼伞多糖对DPPH·和·OH的清除作用

毛头鬼伞多糖对DPPH·和·OH的清除作用如表1所示。可见，毛头鬼伞多糖对DPPH·和·OH都有清除作用，且清除能力随着毛头鬼伞多糖质量浓度的增大而清除能力增大，即清除率与毛头鬼伞多糖质量浓度间存在一定量效关系。

表1 毛头鬼伞多糖对DPPH·和·OH的清除作用

3 结论与讨论

本实验采用微波辅助提取毛头鬼伞多糖，通过因素实验得到微波辅助提取毛头鬼伞多糖的条件为料液比1∶40(g/mL)，微波功率600 W，微波时间60 s，在该条件下测得毛头鬼伞多糖的平均提取率为5.40%，加样回收率为98.76%，RSD值为0.73%。该提取方法操作简单、重复性好、回收率高，是一种较为理想的提取毛头鬼伞多糖的方法，可为毛头鬼伞多糖的提取提供依据。

本研究从清除DPPH·和·OH的能力2个方面测定了毛头鬼伞多糖的抗氧化性。试验结果表明，毛头鬼伞多糖对DPPH·和·OH具有较强的清除作用，在多糖质量浓度为0.0040～0.020 mg/mL范围内，对DPPH·和·OH的清除率分别达到76.28%和54.24%，说明所提取的毛头鬼伞多糖具有较强的抗氧化性。毛头鬼伞多糖有望开发成天然抗氧化剂应用于医药、食品等行业，为毛头鬼伞多糖的进一步开发利用提供理论依据。

本研究结果表明，毛头鬼伞多糖具有较强的抗氧化活性，相关研究结果对毛头鬼伞多糖的提取及抗氧化活性成分的开发利用提供理论依据。但由于本研究仅对微波辅助提取的毛头鬼伞多糖进行抗氧化性测定，而采用微波辅助提取是否会影响毛头鬼伞多糖多糖生物活性尚未知晓，因此在后续的试验中可对不同提取方法与活性之间的关系进行深入研究。