黑果枸杞多糖提取及脱蛋白、脱色最佳工艺的研究

贾文聪， 伊明·尕哈甫， 古丽格娜·吐尔地， 陈丹溪， 李玉玲， 王晨琪， 古丽巴哈尔·卡吾力

(1新疆医科大学药学院药学2014-2班； 2新疆医科大学药学院， 乌鲁木齐 830011)

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)为茄科枸杞属多棘刺灌木，主要分布于我国的宁夏、青海、新疆等西部地区[1-2]。黑果枸杞是我国传统的药食兼用的名贵药材，主要化学成分有蛋白质、脂肪、多糖、黄酮、原花青素、微量元素以及氨基酸等，长期服用具有保护视力、防治糖尿病、保肝、抗肿瘤、降压，保护心血管系统等作用[3-4]。黑果枸杞多糖(LyciumruthenicumMurr. polysaccharides，LBP)是其中的主要有效成分，具有免疫调节、抗肿瘤、抗疲劳、抗氧化以及降血糖、降血脂等功效，临床多用于治疗胃癌、肝癌[5-14]。目前，黑果枸杞多糖的提取方法主要有水浸提取法、酸碱法、超声波提取法、微波法、酶法等。本研究分别采用单因素和正交试验设计，通过超声波提取黑果枸杞多糖，采用Saveg法和过氧化氢法，探究黑果枸杞多糖的提取、脱蛋白、脱色的最佳工艺，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料与试剂牛血清白蛋白(纯度≥98%，南京奥多富尼生物科技有限公司，批号20170510)，葡萄糖标准品(纯度≥98%，纯优生物制品有限公司，批号20170314)，木瓜蛋白酶(活力单位≥600 U/g，坛墨质检科技有限公司，批号20170112)，苯酚(济南钧源化工有限公司，批号20161203)，浓硫酸(天地奥化工有限公司，批号20170320)，无水乙醇(济南钧源化工有限公司，批号20170403)，石油醚(西安义信化工有限公司，批号20161124，沸程60-90℃)；乙醚(西安义信化工有限公司，批号20161025)，95%乙醇(济南钧源化工有限公司，批号20170104)，丙酮(济南钧源化工有限公司，批号20170316)，试剂均为分析纯。

1.2仪器UV-9100型紫外可见分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司)，XL-02A型扣压式小型粉碎机(旭朗机械有限公司)，HWS24型电热恒温水浴锅(上海恒科学仪器有限公司)，SHZ型循环真空泵(郑州博科仪器设备有限公司)，XPE型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，DP-D65UE型多用途恒温超声波提取机 (无锡德谱仪器制造有限公司)。

1.3药材黑果枸杞2016年4月采自于新疆维吾尔自治区阿克苏市，经过新疆医科大学药学院生药/天药教研室帕丽达教授鉴定为茄科枸杞属植物黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)的干燥果实。

1.4方法

1.4.1 多糖的提取方法 将采集的黑果枸杞清洗后在阴凉处干燥至恒重，用粉碎机粉碎并过40目筛，采用索氏提取器用石油醚提取6.0 h脱脂后，加入500 mL蒸馏水于80℃水浴搅拌加热2 h，过滤，滤渣重复提取1次，合并2次滤液，3 000 r/min离心15 min，将提取液减压浓缩至200 mL，加入无水乙醇使乙醇浓度达到80%，于4℃醇沉12 h后，离心分离，收集沉淀，依次用95%乙醇，无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤2次，真空干燥至恒重，即得黑枸杞多糖。

1.4.2 多糖含量测定方法学考察

1.4.2.1 标准曲线的绘制 称取葡萄糖标准品50 mg置于500 mL 容量瓶中定容，分别吸取 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL 葡萄糖标准品溶液，用蒸馏水补足至2.0 mL，加入1.0 mL 6%的苯酚后混匀，迅速加入 5.0 mL 浓硫酸，静置 5 min 后混匀，水浴加热 5 min，冷却至室温，测定490 nm 处吸光度，以 2.0 mL 蒸馏水作为空白对照。以吸光度值为纵坐标(X)，葡萄糖含量(Y)为横坐标绘制标准曲线，得回归方程：Y=0.013 8X+0.023 4，R2=0.999 1。

1.4.2.2 精密度试验 吸取0.02、0.04、0.06 mg/mL 3种浓度葡萄糖标准溶液1.0 mL，按“1.4.2.1”项下方法连续测定5次，RSD分别为1.3%、1.5%、1.8%,表明试验度良好。

1.4.2.3 稳定性试验 吸取0.02、0.04、0.06 mg/mL 3种浓度葡萄糖标准溶液1.0 mL，按“1.4.2.1”项下方法分别在0、2、4、6、8、10 h测定，RSD分别为2.1%、1.3%、1.5%,表明试验稳定性良好。

1.4.2.4 加样回收率考察 吸取9份已知多糖浓度的供试品1.0 mL，分别加入0.02、0.04、0.06 mg/mL 3种浓度的葡萄糖标准品溶液1.0 mL，按“1.4.2.1”项下方法测定，平均回收率分别为99.73%、98.01%、99.12%。

1.4.3 超声波提取黑果枸杞多糖 称取5份脱脂处理后的黑果枸杞各1.0 g，设置料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)、超声时间(15、30、45、60、75 min)、超声功率(40、50、60、70、80 W)，在90℃进行超声波提取，提取液醇沉洗涤，离心、冷冻干燥，按“1.4.2.1”项下方法测定，按公式：多糖提取率/%=X1/X2×100%[式中：X1为黑果枸杞多糖质量(μg)；X2为黑果枸杞药材质量(μg)]计算多糖提取率。根据单因素试验结果，选择9(34)正交试验设计进一步优化提取方法，见表1。

表1 多糖提取正交试验因素水平表

1.4.4 黑果枸杞多糖Saveg法脱蛋白工艺

1.4.4.1 蛋白标含量测定 称取牛血清白蛋白20 mg，置50 mL容量瓶中，加水溶解后稀释至刻度制成贮备液。分别吸取贮备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，加水稀释至l0 mL，向各管中加入5 mL考马斯亮蓝G250，以蒸馏水为空白，在465 nm处测定蛋白质含量，以吸光度值为纵坐标，蛋白质含量为横坐标绘制标准曲线，用最小二乘法拟合校准曲线方程为Y=0.014 8X+0.330 1，R2=0.999 2。

1.4.4.2 黑果枸杞多糖脱蛋白工艺 称取5份黑果枸杞粗多糖10 mg置10 mL容量瓶中，加水稀释至刻度。吸取粗多糖溶液2.0 mL，固定Saveg试剂中氯仿∶正丁醇=1∶4比例，设置Saveg试剂与粗多糖溶液比例(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)、处理时间(60、70、80、90、100 min)、处理温度(55、65、75、85、95℃)进行震荡脱蛋白处理，3 000 r/min离心15 min，弃去沉淀，上清液按照“1.4.2.1”项下方法测定多糖和蛋白质质量浓度，按公式：多糖保留率/%=X1/X2×100%[式中：X1为黑果枸杞多糖脱蛋白后多糖质量浓度(μg/mL)；X2为黑果枸杞多糖脱蛋白前多糖质量浓度(μg/mL)]，计算其多糖保留率,按公式：蛋白脱除率/%=C1/C2×100%[式中：C1为黑果枸杞多糖脱蛋白前粗多糖中蛋白质质量浓度(μg/mL)；C2为黑果枸杞多糖脱蛋白后粗多糖中蛋白质质量浓度(μg/mL)]， 计算其蛋白脱除率。根据单因素试验结果，选择L9(34)正交试验设以综合评分法给予多糖保留率和脱蛋白率各50%权重计算综合得分进一步优化脱蛋白方法，见表2。

1.4.5 黑果枸杞多糖过氧化氢脱色工艺 称取5份黑果枸杞粗多糖10 mg置10 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，配制成粗多糖溶液。吸取粗多糖溶液2.0 mL，设置过氧化氢加入量(0.50、0.75、1.00、1.25、1.50%)、处理时间(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)、处理温度(35、45、55、65、75℃)进行处理，离心，弃去沉淀，上清液按照含量测定方法测定多糖质量浓度，按公式：脱色率/%=C1/C2×100%[式中：C1为黑果枸杞多糖脱色前粗多糖质量浓度(μg/mL)；C2为黑果枸杞多糖脱色后粗多糖质量浓度(μg/mL)]，计算脱色率。根据单因素试验结果，选择L9(34)正交试验设计以多糖脱色率为考察指标选择黑果枸杞多糖脱色工艺参数，见表3。

表2 Saveg法脱蛋白正交试验因素水平表

表3 过氧化氢法脱色正交试验因素水平表

1.5统计学处理采用SPSS20.0统计学软件对实验数据进行方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1超声波提取黑果枸杞多糖试验结果

2.1.1 单因素试验结果

2.1.1.1 料液比对黑果枸杞多糖提取率的影响 按“1.4.3”项下方法测得多糖提取率，分别考察料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50时黑果枸杞多糖提取率的变化，当料液比为1∶10时，多糖提取率为5.80%，达到最高，故选择1∶10为料液比，见图1。

图1 料液比对黑果枸杞多糖提取率的影响

2.1.1.2 超声时间对黑果枸杞多糖提取率的影响 按“1.4.3”项下方法测得多糖提取率，分别考察超声时间为15、30、45、60、75 min时黑果枸杞多糖提取率的变化，当超声时间为30 min时，多糖提取率为5.59%，达到最高，故选择30 min为超声时间，见图2。

图2 超声时间对黑果枸杞多糖提取率的影响

2.1.1.3 超声功率对黑果枸杞多糖提取率的影响 按“1.4.3”项下方法测得多糖提取率，分别考察超声功率为40、50、60、70、80 W时黑果枸杞多糖提取率的变化，当超声功率为60 W时，多糖提取率为5.51%，达到最高，故选择60 W为超声功率,见图3。

图3 超声功率对黑果枸杞多糖提取率的影响

2.1.2 正交试验结果 根据单因素试验分析结果，正交试验选择料液比(1∶10、1∶20、1∶30)、超声时间(15、30、45 min)、超声功率(50、60、70 W)3个因素进行分析，结果表明超声时间和超声功率影响最大，各因素对多糖提取率影响主次序为C>B>A，超声提取黑果枸杞多糖的最佳工艺组合为A3B2C1，即料液比为1∶10、超声时间为30 min、超声功率为70 W。按照此条件进行测定，黑果枸杞多糖的提取率为7.01%，见表4、5。

表4 超声波提取多糖正交试验结果

表5 方差分析结果

2.2黑果枸杞多糖脱蛋白工艺结果

2.2.1 单因素实验结果

2.2.1.1 Saveg试剂与粗多糖比例对黑果枸杞多糖脱蛋白率的影响 按“1.4.4.2”项下方法测得多糖保留率和蛋白脱除率，分别考察Saveg试剂与粗多糖比例为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5时黑果枸杞多糖保留率和蛋白脱除率的变化，当Saveg试剂与粗多糖比例为1∶3时，多糖保留率(53.05%)和蛋白脱除率(51.32%)达到最高，故选择1∶3为Saveg试剂与粗多糖比例，见图4。

2.2.1.2 处理时间对黑果枸杞多糖脱蛋白率的影响 按“1.4.4.2”项下方法测得多糖保留率和蛋白脱除率，分别考察处理时间为60、70、80、90、100 min时黑果枸杞多糖保留率和蛋白脱除率的变化，当处理时间为80 min'时，多糖保留率(77.11%)和蛋白脱除率(69.08%)达到最高，故选择80 min为处理时间，见图5。

图4 Saveg试剂与粗多糖比例对黑果枸杞多糖脱蛋白率的影响

图5 处理时间对黑果枸杞多糖脱蛋白率的影响

2.2.1.3 处理温度对黑果枸杞多糖脱蛋白率的影响 按“1.4.4.2”项下方法测得多糖保留率和蛋白脱除率，分别考察处理温度为55、65、75、85、95℃时黑果枸杞多糖保留率和蛋白脱除率的变化，当处理温度为75℃时，多糖保留率(46.89%)和蛋白脱除率(77.26%)达到最高，故选择75℃为处理时间，见图6。

图6 处理温度对黑果枸杞多糖脱蛋白率的影响

2.2.2 正交试验结果 根据单因素试验分析结果，正交试验选择Saveg试剂加入量(1∶2、1∶3、1∶4)、处理时间(60、70、80 min)、处理温度(75、85、95℃)3个因素进行分析，3个因素影响差异都具有统计学意义(P<0.05)，各因素对多糖脱蛋白率影响主次序为A >C>B，黑果枸杞多糖脱蛋白率工艺最佳组合为A1B1C3，即Saveg试剂与粗多糖比例为1∶2，处理时间为60 min、处理温度为95℃。在此结果上，进一步进行验证试验，多糖脱蛋白率为75.46%，为黑果枸杞多糖脱蛋白方法最佳条件，见表6、7。

表6 多糖脱蛋白率正交试验结果

表7 方差分析结果

2.3黑果枸杞多糖脱色工艺结果

2.3.1 单因素试验

2.3.1.1 过氧化氢加入量对黑果枸杞多糖脱色率的影响 按“1.4.5”项下方法测得多糖脱色率，分别考察过氧化氢加入量为0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%时黑果枸杞多糖脱色率的变化，当过氧化氢加入量为0.75%时，多糖脱色率(44.54%)达到最高，故选择0.75%为过氧化氢加入量，见图7。

图7 过氧化氢的加入量对黑果枸杞多糖脱色率的影响

2.3.1.2 处理时间对黑果枸杞多糖脱色率的影响 按“1.4.5”项下方法测得多糖脱色率，分别考察处理时间为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h时黑果枸杞多糖脱色率的变化，当处理时间为2 h时，多糖脱色率(45.97%)达到最高，故选择2 h为处理时间，见图8。

图8 处理时间对黑果枸杞多糖脱色率的影响

2.3.1.3 处理温度对黑果枸杞多糖脱色率的影响 按“1.4.5”项下方法测得多糖脱色率，分别考察处理温度为35、45、55、65、75 ℃时黑果枸杞多糖脱色率的变化，当处理温度为55 ℃时，多糖脱色率(53.58%)达到最高，故选择55 ℃为处理温度，见图9。

图9 处理温度对黑果枸杞多糖脱色率的影响

2.3.2 正交试验结果 根据单因素试验分析结果，正交试验选择过氧化氢加入量(0.75、1.00、1.25%)、处理时间(1.0、1.5、2.0 h)、处理温度(35、45、55℃)3个因素进行分析，3个因素的影响差异有统计学意义(P<0.05)，各因素对多糖脱色率影响主次序为B>C>A，黑果枸杞多糖脱色率工艺最佳组合为A2B3C2，即过氧化氢加入量为1.0%，处理时间为2.0 h、处理温度为45℃。在此结果上，进一步进行验证试验，多糖脱色率为62.34%，为黑果枸杞多糖脱色方法最佳条件，见表8、9。

表8 多糖脱色率正交试验结果

表9 方差分析结果

3 讨论

黑果枸杞是药食两用的珍贵药材，它生长在人类无法生存的荒山野岭、河床沙滩，拥有着极强的生命力。但随着人类对大自然的开发，黑果枸杞的生存空间愈来愈少，造就了黑果枸杞这一珍稀珍贵的原生态高档滋补佳品。研究表明黑枸杞含蛋白质、枸杞多糖、氨基酸、维生素、矿物质、微量元素等多种营养成分，比一般红枸杞更珍贵更有药用价值，用于治疗心热病、心脏病、降低胆固醇、兴奋大脑神经、增强免疫功能、防治癌症、抗衰老、美容养颜、月经不调、停经等且药效显著[15-20]。

本研究以多糖提取率为评价指标，通过单因素和正交试验设计，分别超声波方法提取多糖，确定黑果枸杞多糖提取条件。结果显示超声波提取多糖时，料液比为1∶10、超声时间为30 min、超声功率为70W时多糖提取率就可以达到7.01%。以蛋白脱除率和多糖保留率为考察指标对黑果枸杞多糖进行脱蛋白，当Saveg试剂与粗多糖比例为1∶2，处理时间为60 min、处理温度为95℃。在此结果上，进一步进行验证试验，多糖脱蛋白率为75.46%。以脱色率为评价指标对黑果枸杞多糖进行脱色，当过氧化氢加入量为1.0%，处理时间为2.0 h、处理温度为45 ℃时多糖脱色率为62.34%。通过上述试验对黑果枸杞多糖进行提取、脱蛋白和脱色，得到淡黄色多糖粉末，其工艺结果稳定、可靠、影响因素较少，初步确定为黑果枸杞多糖提取、脱蛋白和脱色工艺，为黑果枸杞后续研究提供理论依据和试验基础。