水稻黑条矮缩病毒P7-1基因对水稻的遗传转化及转基因植株的抗病性分析

袁平平 孙枫 倪海平 朱佳慧 周益军 蒋选利 徐秋芳,*



水稻黑条矮缩病毒基因对水稻的遗传转化及转基因植株的抗病性分析

袁平平1, 2孙枫2倪海平2朱佳慧2周益军2蒋选利1,*徐秋芳2,*

(1贵州大学农学院, 贵阳 550025;2江苏省农业科学院 植物保护研究所, 南京 210014；*通讯联系人, E-mail: xuqiufang@jaas.ac.cn; JXL3237@163.com)

【目的】通过在水稻中过量表达水稻黑条矮缩病毒(, RBSDV)基因，分析RBSDV是否是导致水稻不育的重要致病因子，并明确过量表达转基因植株对病毒的抗性。【方法】采用RT-PCR方法从感病植物中扩增获得RBSDV基因，构建pCAMBIA-1300-P7-1载体，通过农杆菌转化法获得转基因水稻，观察水稻是否能够正常结实，并采用人工接种病毒方法分析转基因植株的抗性。【结果】过量表达RBSDV的转基因水稻生长、结实正常。在接种7 d和14 d时转基因植株中病毒积累量显著低于野生型对照，但在28 d时部分转基因株系中病毒积累量高于对照，接种30 d时转基因植株的发病率与对照无明显差异。【结论】在水稻中过量表达RBSDV不影响水稻的结实；转基因水稻在RBSDV侵染早期可抑制病毒的积累，但在后期对病毒的抗性与对照没有明显差异。

水稻黑条矮缩病毒；过量表达；育性；抗性评价

水稻黑条矮缩病毒(, RBSDV)为呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属()成员，主要通过介体灰飞虱以持久增殖方式传播，可侵染水稻、小麦、玉米等禾本科植物[1]。水稻感染该病毒后表现为植株矮缩，叶色浓绿，不抽穗或穗小，叶脉和茎秆上早期出现蜡白色、后期出现黑褐色的瘤状突起[2]。20世纪60年代和90年代后期，水稻黑条矮缩病在我国暴发流行，部分地区病害发生率超过了90%[3]。2007年以来，该病害又在江苏等地粳稻上普遍发生，2008年仅江苏省发病面积达26.7万hm2，2009年增加到33.3万 hm2，且由于目前生产上推广的品种绝大多数不抗水稻黑条矮缩病，对水稻生产造成巨大威胁[4]。

RBSDV病毒基因组由10条线性双链RNA组成，根据其在聚丙烯酰胺凝胶上的迁移速率由快到慢的顺序依次称为S1~S10。S7全长2193 nt，编码363个氨基酸，含有两个不重叠的ORF，编码两个蛋白P7-1和P7-2，均为病毒的非结构蛋白[5]。在感病植物和介体昆虫中均可检测到P7-1蛋白的表达，但在不同寄主中的大小存在差异。在感病植物中P7-1蛋白的大小为41 kD，而在昆虫中则为44 kD，暗示P7-1在不同的寄主中可能存在不同的修饰[6]。免疫胶体金标记显示P7-1在管状结构中大量存在，表明其为管状结构的主要组成部分，在RBSDV侵染的细胞中，管状结构常常不完全封闭，其中含有大量病毒颗粒[6]。P7-1的亚细胞定位分析表明，该蛋白在质壁分离的细胞中可定位于细胞核、细胞质、细胞周围，并与胞间连丝的标记蛋白PDLP1存在共定位[7]。

植物感染RBSDV后表现矮化，不能正常抽穗结实。在非寄主植物拟南芥中过量表达RBSDV基因后花药不能开裂，花药中的木质素含量显著下降，转基因植株不能正常结实[8]。由于拟南芥不是RBSDV的寄主植物，为进一步研究RBSDV基因功能，明确其是否是导致寄主植物不育的致病因子，我们构建了pCAMBIA1300-P7-1的重组表达载体，转化水稻日本晴，获得了过量表达RBSDV P的转基因植株，并分析了转基因植株对病毒的抗性。

1 材料与方法

1.1 材料

用于扩增水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)基因的感病水稻采自江苏省泰州市姜堰区，用于接种的灰飞虱由江苏省农业科学院植物保护研究所病害室饲养保存。用于遗传转化的水稻品种为日本晴。

1.2 RBSDV P7-1基因的克隆

根据NCBI数据库中RBSDV基因(登录号：AF397894)序列设计扩增基因的PCR引物-I-F和-I-R(表1)，扩增产物的理论大小为1089 bp。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

采用Trizol试剂(TaKaRa)提取感染RBSDV的水稻叶片总RNA，利用反转录试剂盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser, TaKaRa)合成cDNA。PCR体系如下：cDNA 1.0 μL，上下游引物各0.5 μL，10×缓冲液2.5 μL，dNTP 0.5 μL，酶0.5 μL，加ddH2O补足至25.0 μL。PCR条件如下：94℃下5 min；94℃下1 min，56℃下40 s，72℃下1 min，32个循环；72℃下延伸10 min。

的PCR扩增产物经DNA回收后连接至pMD18-T载体，采用菌落PCR筛选阳性克隆后，提取质粒，酶切鉴定插入片段大小。酶切正确的质粒进行测序，基于NCBI数据库进行核酸序列比对，采用DNASTAR软件分析氨基酸序列的同源性，获取pMD18T-P7-1重组质粒。

表1 本研究所用引物

1.3 重组表达载体pCAMBIA-1300-P7-1的构建

用限制性内切酶I和I酶切pMD18T- P7-1重组质粒，酶切所得基因片段回收后用T4连接酶定向连接至pCAMBIA-1300表达载体。采用扩增基因引物进行PCR，筛选阳性克隆，采用I和I酶切阳性克隆质粒，获得pCAMBIA-1300-P7-1重组表达载体。

1.4 农杆菌介导的遗传转化及转基因水稻的检测

1.4.1 农杆菌介导的遗传转化

挑选成熟、饱满的水稻种子，去颖壳后进行水稻愈伤组织的诱导和继代培养，将pCAMBIA- 1300-P7-1质粒采用电击法导入GV3101农杆菌，挑选愈伤组织后进行农杆菌转化，在筛选培养基上筛选后，进行分化、生根培养，获得T0转基因植株。

1.4.2 转基因水稻鉴定

采用CTAB法提取T0代转基因植株叶片总DNA。用扩增潮霉素磷酸转移酶()基因的引物-F和-R进行PCR检测。采用Trizol法提取转基因植株叶片总RNA后，反转录获得cDNA，用-F/-R(表1)和-I-F/-I-R引物分别检测和基因的表达。

T0阳性转基因植株收种后，采用CTAB法提取T1转基因植株叶片DNA，采用引物进行PCR检测，收取分离比接近3∶1的T1转基因植株的种子，检测对应T2株系分离情况，T2株系不发生分离的认为是纯合转基因株系。

1.5 RBSDV P7-1基因表达分析

提取培养20 d的T2代转基因植株叶片总RNA，反转录获得cDNA，采用扩增的引物(-I-F/-I-R)进行PCR扩增，分析转基因植株中基因是否表达。此外，采用荧光定量PCR(qRT-PCR)分析基因的相对表达量。基因的扩增引物为-F1和-R1，的扩增引物为-F和-R(表1)。qRT-PCR参照Xu等[10]的方法进行。

1.6 转基因植株对RBSDV的抗性分析

挑选4个T2代纯合转基因株系(#-14，#-19，#-40，#-46)，采用人工接种方法接种RBSDV，以野生型日本晴作为对照。人工接种RBSDV参照周彤等[9]的方法进行，略有修改。将1~2龄无毒灰飞虱若虫在感染RBSDV的水稻病株上饲喂7 d后，转接至武育粳3号水稻幼苗上，饲养7 d使其度过循回期，采用ELISA方法检测灰飞虱的带毒率，将携带RBSDV的灰飞虱按2或3头/株的虫量接种于3叶期野生型日本晴和T2代转基因水稻上，每株苗接种3头有效虫；同时接种不携带RBSDV的无毒灰飞虱作为对照。接种2~3 d后将水稻苗移栽至大田，接种30 d后统计发病率。

人工接种RBSDV 7 d、14 d、21 d、28 d时，将每个品系的水稻叶片进行混合取样，提取总RNA，反转录合成cDNA。采用qRT-PCR分析转基因植株和对照植株中编码病毒外壳蛋白的基因表达情况，以水稻为内参基因。RBSDV引物为RBSDV-F和RBSDV-R。qRT-PCR参照Xu等[10]的方法进行。

A－PCR扩增RBSDV P7-1基因(M－DNA标记，泳道1和2分别为以健康和感病植株cDNA扩增P7-1的PCR产物)；B－PCR筛选pMD18T-P7-1阳性克隆；C和D－pMD18-T-P7-1和pCAMBIA-1300-P7-1质粒的酶切分析(泳道5和7为重组质粒酶切产物，泳道6和8为未酶切的质粒对照)。

Fig. 1. Construction of the pCAMBIA-1300-P7-1 expression vector.

2 结果与分析

2.1 水稻黑条矮缩病毒P7-1基因克隆及序列分析

以感染RBSDV的水稻cDNA为模板，采用-I-F/-IR为引物，PCR扩增基因。琼脂糖凝胶电泳分析表明，PCR扩增获得一条约1.1kb的条带，与目的基因理论大小1089 bp相符(图1-A)。PCR产物回收后连接pMD18-T载体，转化大肠杆菌后采用PCR筛选获得阳性克隆(图1-B)。阳性克隆质粒用I和I进行双酶切，可获得一条与目的基因大小一致的条带(图1-C)，表明基因已连入pMD18-T载体。pMD18T-P7-1测序结果表明，克隆所得基因ORF长为1089 bp，编码363个氨基酸。在NCBI网站进行比对分析，发现测序所得序列与RBSDVCDS核酸序列(登录号：AF397894)有2个碱基的差异，同源性为99.8%，蛋白序列比对发现有1个位点的差异，同源性为99.7%，表明扩增所得基因为RBSDV基因。

2.2 重组表达载体pCAMBIA-1300-P7-1的构建

采用限制性内切酶I和I酶切pMD18T-P7-1质粒，获得基因片段，回收后定向连接至经相同酶酶切的pCAMBIA-1300植物双元表达载体，获得重组表达载体pCAMBIA- 1300-P7-1。重组载体用I/I进行酶切鉴定，结果显示pCAMBIA-1300-P7-1双酶切后可获得与理论大小一致的条带(图1-D)，表明成功构建获得重组表达载体pCAMBIA-1300-P7-1。

2.3 农杆菌介导的遗传转化和分子检测

采用农杆菌介导法将pCAMBIA-1300-P7-1转化至水稻日本晴。经愈伤诱导、共培养、筛选、分化和生根等步骤，在含有潮霉素的培养基上筛选获得52株具有抗性的T0代转基因植株。为明确所得T0转基因植株是否为阳性转基因植株，提取T0转基因植株叶片DNA后，PCR扩增基因，结果显示PCR可扩增获得大小约1 kb的条带(图2)，与目的片段大小(1009 bp)一致，表明所检测T0植株为转基因阳性植株。

提取T0转基因植株叶片总RNA后，进行RT-PCR，分析和RBSDV基因的表达情况。结果显示，T0转基因植株中可扩增获得与和基因大小相符的条带(图3)，表明RBSDV基因在转基因植株中表达。

2.4 转基因水稻中RBSDV P7-1基因的表达分析

为明确T2转基因植株中基因的表达情况，采用RT-PCR和qRT-PCR分析了4个T2纯合转基因株系(#-14，#-19，#-40，#-46)中的表达情况。PCR结果表明，在4个株系中均有表达(图4)。qRT-PCR结果分析显示，在4个转基因株系中RBSDV的相对表达量分别为基因的0.32、26.3、38.17和17.55倍(图5)。

M－DNA标记；1~52：转基因植株。

M, DNA marker, Lanes 1 to 52, Transgenic rice lines.

图2 T0转基因植株的PCR检测

Fig. 2. PCR identification of T0transgenic plants.

A－RBSDV P7-1基因扩增; B－HPT基因扩增。M－DNA标记；1~52：转基因植株。

Fig. 3. Expression analysis ofandgene in T0transgenic plants by RT-PCR.

M, DNA标记; #-14, #-19, #-40和#-46, T2转基因株系。下同。

Fig. 4. Detection ofgenes in T2plants by RT-PCR.

柱上标不同小写字母代表差异达0.05显著水平。

Fig. 5. Expression ofgene in T2transgenic plants by qRT-PCR.

2.5 转基因水稻对RBSDV的抗性分析

RBSDV转基因植株的生长状态和结实情况与对照相似，均可正常结实(图6)，表明基因过量表达不影响水稻的结实。为分析过量表达转基因水稻对RBSDV是否具有抗性，转基因植株接种RBSDV后，采用qRT-PCR分析了过量表达对病毒积累量的影响。在接种病毒7 d和14 d时，转基因植株中病毒的积累量显著低于野生型对照，接种7 d时，#-14、#-19、#-40和#-46中基因的表达量分别为对照的11.5%、5.7%、6.2%和21.3%。在接种21 d时，4个转基因株系中有2个株系的病毒积累量低于对照，但至接种28 d时，#-19和#-46转基因植株中病毒的积累量与对照无显著性差异，#-14和#-40植株中病毒积累量甚至显著高于对照(图7)。以上结果表明，转基因植株仅在病毒侵染早期对病毒具有一定的抗性。

RBSDV接种转基因植株30 d后，统计发病率。每株接种3头带毒虫，4个转基因株系及对照的发病率分别为81.1%、86.7%、84.6%、80.0%和87.5%。每株接种2头带毒虫，4个转基因株系及对照的发病率分别为70.6%、75.0%、92.0%、72.2%和80.0%，表明过量表达基因后转基因植株对RBSDV不具有抗性。

3 讨论

由RBSDV侵染引起的水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病自20世纪60年代发生流行至今，已有50多年的历史。近年来，随着分子生物学等技术的发展，在RBSDV病毒基因功能、病毒与植物互作及病毒致病机制等方面均取得了较大进展[10-13]。RBSDV侵染寄主植物后的转录组和miRNA测序、蛋白质组分析等结果表明细胞壁合成相关基因、激素途径等可能调控了植株矮缩、不育等症状[14-15]，但病毒侵染导致植物矮缩并影响结实的机制还有待深入研究。已有研究表明RBSDV P7-1蛋白在拟南芥中过量表达后，花药不能开裂进而导致转基因植株不能结实，P7-1很有可能是病毒侵染后导致植株不育的重要因子[8]。为分析P7-1蛋白在病毒致病过程中的作用，我们在水稻中过量表达了基因，然而，转基因水稻并未表现不能结实的症状，其后代植株也能正常结实(图6)。因此，P7-1是否是病毒侵染后导致植物不育的致病因子还需进一步研究。

通过表达病毒基因获得抗病转基因植物是抗病毒基因工程的主要策略之一。自1986年在烟草中过量表达烟草花叶病毒(TMV)外壳蛋白基因获得能稳定遗传的抗病毒转基因烟草以来[16]，利用病毒蛋白基因如外壳蛋白、病毒复制酶基因和运动蛋白等介导植物对病毒产生抗性有许多成功例子[17-18]。为明确本研究获得的过量表达RBSDV转基因植株是否具有对病毒的抗性，我们采用人工接种RBSDV的方法分析了转基因植株对病毒的抗性。结果显示，接种病毒7 d和14 d时，转基因植株中病毒积累量显著低于对照，但至接种28 d时转基因植株中的病毒积累量没有下降，且接种30 d时转基因植株发病率与对照没有显著差异，表明过量表达的转基因植株不具有对RBSDV抗性。有研究报道，在水稻中过量表达水稻矮缩病毒(RDV)的非结构蛋白Pns11的转基因植株不表现对RDV的抗性[19]。这表明在植物中表达病毒的非结构蛋白基因不一定能产生对病毒的抗性。

病毒运动蛋白基因可介导植物对病毒抗性。将番茄斑驳病毒(TMoV)或烟草花叶病毒(TMV)缺失突变后的运动蛋白导入烟草后，转基因烟草可以抑制TMoV或TMV病毒侵染[20-22]。将菜豆矮化花叶病毒(BDMV)野生型或突变的运动蛋白BV1或BC1基因导入到番茄后转基因番茄能推迟ToMV的感染[23]。RBSDV P7-1可在细胞内形成管状结构[7,24]，在植物中P7-1可定位于胞间连丝处[7]。转基因植株在接种病毒7 d和14 d时，病毒积累量显著低于对照，推测过量表达后在胞间连丝处通过影响病毒细胞间运动减缓病毒侵染。

WT, 野生型; #-14, #-19, #-40和#-46, T2转基因株系。下同。

Fig. 6. Seed setting of the T2transgenic plants with overexpression of RBSDV.

*代表与野生型相比差异达0.05显著水平。

Fig. 7. Relative expression of RBSDVin transgenic plants as infected by virus for various time.

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Genetic Transformation ofGene in Rice and Its Virus Resistance Analysis

YUAN Pingping1, 2, SUN Feng2, NI Haiping2, ZHU Jiahui2, ZHOU Yijun2, JIANG Xuanli1,*, XU Qiufang2,*

(1College of Agriculture, Guizhou University, Guiyang 550025, China;2Institute of Plant Protection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;*Corresponding author, E-mail: xuqiufang@jaas.ac.cn; JXL3237@163.com)

【Objective】The purpose of this study is to determine whether(RBSDV)is an important pathogenic factor related to infertility in rice and to analyze the resistance of thetransgenic rice to RBSDV by overexpression ofin rice. 【Method】RBSDVgene was amplified from virus-infected plants by RT-PCR. The recombination plasmid pCAMBIA-1300-P7-1 was constructed and transformed to rice bytransformation. The fertility of transgenic plants was evaluated and the resistance of the transgenic rice plants to RBSDV was identified by artificial inoculation of virus. 【Result】The transgenic plants showed normal growth and fertility. The virus accumulation in the transgenic plants was significantly lower than the wild type at 7 days and 14 days after inoculation, but it was higher in some transgenic lines than the control at 28 days after inoculation. There were no significant differences in disease incidence between the transgenic plants and the wild type at 30 days after inoculation. 【Conclusion】 Overexpressing RBSDVin rice does not affect the fertility. Transgenic rice had lower accumulation of virus in the early stage after RBSDV infection, but did not exhibit resistance to the virus at the later stage.

; overexpression; fertility; resistance evaluation

S435.111.4+9; S511.034

A

1001-7216(2018)04-0342-07

2018-01-05;

2018-05-08。

国家重点研发计划资助项目(2016YFD0300706)；国家自然科学基金资助项目(31471768)。

10.16819/j.1001-7216.2018.8014