水稻条纹叶和白穗基因SLWP的定位及变异分析

周坤能 夏加发 马廷臣 王元垒 李泽福



水稻条纹叶和白穗基因的定位及变异分析

周坤能 夏加发 马廷臣 王元垒 李泽福*

(安徽省农业科学院 水稻研究所, 安徽省水稻遗传育种重点实验室, 国家水稻改良中心合肥分中心, 合肥 230001；*通讯联系人, E-mail: lizefu@aliyun.com)

【目的】对叶绿体发育相关基因进行克隆和功能分析，为解析叶绿体功能奠定分子基础。【方法】用甲基磺酸乙酯(EMS)处理籼稻9311获得一个条纹叶和白穗突变体，通过色素分析和农艺性状观察分析该突变体的表型，通过图位克隆方法分离该基因，进一步利用定量PCR分析相关基因的表达情况。【结果】突变体从2叶期开始至抽穗期表现出条纹叶表型，抽穗后幼穗白化，光合色素含量明显低于野生型；株高降低、抽穗延迟、产量降低等表型。该突变性状为单隐性核基因控制，该基因定位于水稻第6染色体短臂C6-4和N14标记之间0.91 Mb区间内。基因组测序表明核糖核苷二磷酸还原酶小亚基基因()编码区第776位点发生单碱基替换，导致甘氨酸突变为天冬氨酸；该基因与已报导的水稻基因、和为等位基因。通过对这4个等位基因的突变位点和表型进行分析，总结了该基因不同位点突变对植株表型的影响以及籼粳之间的差异。表达分析显示与叶绿素合成有关的基因受到不同程度调控，叶绿体发育第一和第二阶段基因上调表达，光合作用相关基因均下调表达。【结论】本研究分析了()基因不同位点的变异对水稻表型的影响，相关结果加深了对基因功能的认识，有助于阐明叶绿体发育的分子机制。

水稻；突变体；变异分析；表达分析

叶绿素广泛存在于绿色高等植物、绿藻、蓝细菌等光合生物中，作为主要的光受体色素参与植物的光合作用[1]；类胡萝卜素参与稳定光系统并使植株避免受到光伤害[2,3]。叶绿素缺失突变体是研究叶绿素合成、叶绿体发育和光合作用等的理想材料。参与叶片中叶绿素合成途径中的基因已被明确鉴定[4]，然而，叶绿素代谢是一个复杂的代谢过程，仍有许多调控基因还未被鉴定。

水稻条纹叶表型受多个基因调控，其分子生物学机理较为复杂。影响叶绿体生物合成相关基因突变后造成叶片白条纹表型，研究表明水稻和基因在3叶期茎基部组织中高表达，即叶绿体发育第一阶段，这两个基因突变后影响质体DNA的合成，阻碍叶绿体分化[5]；水稻、和基因分别在叶绿体发育的第二阶段高度积累，其突变影响叶绿体遗传机制的建立，阻碍叶绿体的形成，造成水稻白条纹表型[6-10]。和属于PPR家族蛋白，与叶绿体中RNA代谢有关，其基因突变造成、、等叶绿体转录本不能被正常剪切，导致叶片产生条纹[11,12]。还有一类定位于叶绿体类核中的蛋白，这些蛋白的主要功能是参与质体转录，调控丙酮酸羧化酶(PEP)和RNA聚合酶有关基因的表达，如和，其突变后损坏PEP活性，造成白条纹表型[13,14]。此外，编码钾离子通道蛋白的基因突变后亦可造成叶片白条纹表型[15]。

然而，目前关于幼穗中叶绿素合成和叶绿体发育的报道较少。李红昌等[16]于籼粳交F6群体中获得一个白穗突变体，并将控制该性状的基因(t)定位于水稻第1染色体。同样地，控制白穗相关性状的基因和被分别定位在水稻第7染色体87 kb和第8染色体79 kb区间内[17,18]。基因编码一个50S核糖体大亚基蛋白L13，其突变体4叶期之前显示明显的白化叶表型，4叶期之后至抽穗期叶片表型正常，抽穗期幼穗呈现白化表型，低温下突变体表型更加明显[19]。基因突变显示两种突变表型，严重时叶片白化，4叶期植株死亡；轻微时叶片从苗期至开花期表现为条纹表型，抽穗后幼穗白化；该基因编码一个缬氨酸-tRNA合成酶，主要参与调控叶绿体核糖体的发育[20]。水稻幼苗条纹基因突变后植株在2叶期至4叶期表现出条纹表型，之后叶色正常，但在抽穗之前植株生长受到抑制，抽穗期叶片显示轻微的条纹表型，幼穗颖壳白化，成熟后种皮仍表现出白化性状[21]。此外，一个控制水稻条白叶和白穗性状的基因与和为等位基因，但其在性状上差异明显[5,22,23]。这3个基因编码同一个蛋白，即核糖核苷酸还原酶小亚基蛋白(RNRS1)。RNRS1是DNA复制和DNA损伤修复必不可少的酶之一，它能够催化核苷二磷酸形成脱氧核苷二磷酸，促进脱氧核苷二磷酸的生成[24]；酵母实验表明RNRS1能够与核糖核苷酸还原酶大亚基蛋白(RNRL1)互作形成异源二聚体，编码该蛋白的基因突变后减弱二聚体的形成，进而影响质体基因组的复制，抑制叶绿体的发育分化[5]。

本研究利用EMS诱变籼稻品种9311获得一个条纹叶和白穗突变体，对其表型和农艺性状进行了分析考查，同时对该突变基因进行遗传分析和精细定位，并通过序列分析确定突变位点；通过突变分析揭示该基因不同位点突变对表型的影响；进一步通过表达分析明确该基因参与调控叶绿素合成、叶绿体发育以及光合作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

水稻条纹叶和白穗突变体由EMS处理籼稻品种9311变异获得，经过多代自交选择，性状稳定遗传。

1.2 光合色素含量测定

利用分光光度计法，测定2叶期、3叶期和分蘖期不同叶片以及抽穗期颖壳中的光合色素含量。3次重复。

表1 本研究所用引物的序列

1.3 主要农艺性状调查

将野生型和突变体同时播种移栽，种植密度为16.67 cm× 26.67 cm，种植面积为6.67 m2，各3次重复。抽穗期调查播始历期，成熟期调查株高、穗长、有效穗数、每穗粒数、结实率、千粒重等农艺性状，10次重复。收获后测量实际产量，3次重复。

1.4 遗传分析和基因定位

利用突变体与野生型9311正反交构建遗传分析群体，种植F2群体1000~1200株，统计正常单株与突变单株的株数，利用卡方测验进行遗传分析。构建和农院238籼粳杂交F2群体，利用10个具有典型突变性状的F2单株和覆盖水稻12条染色体的SSR标记进行连锁分析，再利用134个F2突变单株进行初定位，进一步利用851个F2突变单株并开发新的InDel标记对目的基因进行精细定位。InDel标记根据NCBI (https://www. ncbi.nlm. nih.gov/)公布的9311与日本晴的插入/缺失差异，利用软件Primer Premier 5.0设计，基因定位引物序列见表1。利用引物slwp-g(表1)对突变体和野生型的基因组DNA进行扩增，测序获得核糖核苷二磷酸还原酶小亚基基因(，LOC_Os06g14620)的序列差异。PCR程序为：95℃下5 min；95℃下30 s，55℃下退火30 s，72℃下延伸(1 min/kb)，34个循环；72℃下5 min；4℃下10 min。

1.5 序列分析和蛋白三维结构预测

利用RGAP(http://rice.plantbiology.msu.edu/)数据库预测基因功能，用NCBI(https://www.ncbi.nlm. nih.gov/)数据库蛋白搜索功能预测结构域，并查询与SLWP蛋白高度同源的序列，采用Bioedit软件进行同源比对。利用SWISS-MODEL(https://www. swissmodel.expasy.org/)软件预测蛋白三维结构。

1.6 定量PCR分析

利用天根RNA提取试剂盒(RNA prep pure plant kit)提取3叶期突变体、野生型(9311)和中花11叶片以及抽穗初期9311和中花11幼穗中的总RNA。采用TaKaRa反转录试剂盒(SuperScript Ⅱ kit)反转录得到cDNA，于―20℃下保存备用。采用TaKaRa试剂盒(SYBR®Premix ExTMkit)和Roche定量PCR仪(LightCycler 480 Real-Time PCR System)进行定量PCR，以基因(LOC_ Os03g13170)为内参，利用2法分析结果。定量PCR引物及其序列见表1[14]。

2 结果与分析

2.1 突变体slwp的表型分析

突变体从2叶期开始表现出条纹叶表型，3叶期表型更加明显(图1-A)，分蘖期表型持续，各叶片显示出不同程度的缺绿(图1-B、C)，抽穗期植株叶鞘也表现出条纹表型(图1-D)，同时幼穗明显白化(图1-E、F），成熟期野生型水稻颖壳为金黄色，而突变体颖仍为白色(图1-G）。

A—2叶期和3叶期表型；B和C—分蘖期叶片表型；D—孕穗期叶鞘表型；E和F—抽穗期幼穗表型；G—种子表型。

Fig. 1. Phenotypic characteristics of themutant and its wild type(WT).

chla―叶绿素a；chlb―叶绿素b；a+b―总叶绿素；Car―胡萝卜素。

Fig. 2. Pigments determination of themutant and its wild type(WT).

A—SLWP基因初定位；B—SLWP基因精细定位；C—SLWP基因结构和突变位点；ATG和TGA分别代表起始密码子和终止密码子。

Fig. 3. Map-based cloning of thegene.

表2 野生型和突变体的农艺性状分析

数据结果为10次重复，来源于2015年合肥正季，种植密度为16.67 cm × 26.67 cm，种植面积为6.67 m2。**<0.01。

Values are the mean±SD from ten replications in Hefei, in 2015. The planting density was 16.67× 26.67 cm. The area per plot was 6.67 m2.**<0.01.

色素含量分析表明，2叶期和3叶期不同叶片中叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量明显低于野生型，分蘖期叶片叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量与野生型相比分别降低了18.3%~70.5%、19.3%~72.7%、18.6%~71.1%和19.2%~68.0%(图2-A)。抽穗期突变体颖壳叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量显著低于野生型(图2-B)。

2.2 突变体slwp的农艺性状观察

农艺性状调查显示，突变体与野生型相比，其株高、穗长、每穗粒数和千粒重明显降低，抽穗期延长，理论产量降低，实际产量不足野生型的一半；有效穗数和结实率没有显著差异(表2)。

2.3 SLWP遗传分析和基因定位

构建突变体与野生型9311的正反交F2群体进行遗传分析。F1均表现出正常的野生型表型，/9311的F2群体中正常叶色植株893株，条纹叶植株284株，卡方测验正常叶色与条纹叶植株的分离比符合3∶1(χ2=0.476<χ20.05=3.84)，9311/的F2群体中正常叶色植株734株，条纹叶植株264株，卡方测验正常叶色与条纹叶植株的分离比符合3∶1(χ2=1.124<χ20.05=3.84)，这些结果表明该突变性状受单隐性核基因控制。

同时构建突变体与农院238的籼粳交F2定位群体。首先利用10个具有典型突变体表型的F2单株以及与突变表型连锁的分子标记将目的基因初定位到第6染色体短臂，选取134个F2突变单株进行初定位，将目的基因定位于标记C6-4和C6-6之间(图3-A)。进一步利用851个F2突变单株，开发新的InDel标记，将目的基因定位于标记C6-4和N14之间0.91 Mb区间内(图3-B)。对该定位区间进行基因预测，发现一个与水稻叶片条纹和白穗有关的基因，即核糖核苷二磷酸还原酶小亚基基因(LOC_Os06g14620)。基因组测序显示，在该基因编码区的第776个碱基由G突变为A，导致甘氨酸突变为天冬氨酸(图3-C)。

2.4 SLWP及其同源蛋白的序列分析

序列分析显示基因编码一个含339个氨基酸残基的蛋白且只含有1个外显子(图3-C)。蛋白结构域预测发现该蛋白15－296氨基酸为核苷酸还原酶结构域，该区域高度保守。同源分析表明SLWP蛋白与其他物种如拟南芥、大豆、玉米、烟草和小立碗藓中的同源蛋白具有很高的相似性(图4)。

序列来源于水稻LOC_Os06g14620(SLWP)、拟南芥At3g23580、大豆XP_003547645.1、玉米NP_001130908.2、烟草NP_001312237.1和小立碗藓XP_001768501.1；下划线代表核糖核苷酸还原酶结构域；ST1、STWP、GWS和SLWP蛋白突变位点以红色字体和线框标出。

Fig. 4. Alignment of SLWP and SLWP-related proteins of different organisms.

A—st1、st-wp和slwp；B—突变蛋白gws；红色表示突变位点。

Fig. 5. Prediction of 3D structure model.

2.5 SLWP变异分析

基因与水稻中已报道的、和为等位基因，蛋白的各突变位点均在核苷酸还原酶结构域内，且都是高度保守的氨基酸序列。st1、st-wp和slwp分别在该蛋白的第40、103和259位点发生单氨基酸突变，突变后编码一个只有118个氨基酸残基的截断蛋白，且105位至118位氨基酸与野生型不同(图4)，同时利用蛋白三维结构预测SLWP蛋白及其等位突变蛋白结构，发现st1、st-wp和slwp蛋白突变分别发生在α螺旋内或靠近α螺旋位置(图5-A)，gws蛋白严重缺失了该蛋白的重要结构域(图5-B)。

表3 SLWP变异分析

SLWP蛋白不同位点突变导致不同的表型变化。由粳稻品种FL176突变而来，从4叶期或5叶期至分蘖期表现出明显的条纹表型，抽穗后表型恢复[5]；由粳稻品种日本晴突变而来，从苗期开始直至抽穗期叶片均表现出条纹表型，其农艺性状与野生型相比发生较大变化，其株高、穗长、分蘖数、结实率、千粒重和单株生物量均明显降低[22]；由籼稻品种9311突变而来，从苗期至抽穗期叶片均显示条纹表型，抽穗后幼穗白化，农艺性状与野生型相比差异较大，其株高、穗长、每穗粒数、结实率、千粒重明显降低，抽穗延迟，分蘖数无明显差异[23]；突变表型与较为相似，但突变体中结实率与野生型差异不显著(表3)。这些等位突变体在叶片中均有条纹表型，除农艺性状不变外，其他3个突变体水稻产量均降低；此外，粳稻突变体和未出现白穗。

A—叶绿素合成相关基因表达分析；B—叶绿体发育相关基因表达分析；C—光合作用相关基因表达分析。*和**分别表示5%和1%显著水平。

Fig. 6. Expression analysis of genes involved in chlorophyll biosynthesis, chloroplast development and photosynthesis between wild type(WT) and mutant.

2.6 叶绿素合成、叶绿体发育和光合作用相关基因表达分析

进一步利用定量方法对突变体和野生型中叶绿素合成、叶绿体发育和光合作用有关的基因进行表达分析。叶绿素合成相关基因在突变体中受到不同程度的调控，与野生型相比，NADPH原叶绿素酸酯氧化还原酶基因和叶绿素合成酶基因表达明显上调，谷氨酰-tRNA还原酶基因和镁离子螯合酶Ⅰ亚基基因表达下调，镁离子螯合酶亚基基因和无显著差异(图6-A)；参与叶绿体分化第一阶段(编码质体分化机制原件)和第二阶段相关基因(编码NEP蛋白，和分别编码PEP α和β亚基)表达明显上调(图6-B)；编码核酮糖1,5二磷酸羧化酶大小亚基基因和、编码光系统Ⅰ复合体亚基基因和以及编码光系统Ⅱ复合体亚基基因，和在突变体中表达明显下调(图6-C)。定量PCR检测()及其同源基因基因在粳稻中花11和籼稻9311相同时期不同组织中的表达差异，结果表明()基因在中花11和9311的幼穗和幼叶中表达差异明显，基因在9311的幼穗和幼叶中表达水平明显高于中花11(图7)。

图7 SLWP(RNRS1)和RNRS2在中花11(ZH11)、9311和slwp突变体不同组织中的表达分析

Fig. 7. Expression analysis of() andin different tissues of ZH11, 9311 andmutant.

3 讨论

目前，已克隆了大量通过不同途径参与叶片中叶绿素合成和叶绿体发育的叶色基因[5-15]。然而，影响幼穗中叶绿素合成和叶绿体发育相关基因的报道较少，其中、、以及已被克隆[19-21,23]。白穗突变体往往在苗期即显示出明显的白条纹性状，抽穗期叶片呈现不同粗细的条纹。幼穗白化突变体往往株高降低，植株生长延缓，植株主要农艺性状变差进而产量下降[21,23]。

本研究通过自然变异获得一个幼穗白化突变体，经基因精细定位和克隆发现该基因编码一个核糖核苷酸还原酶小亚基蛋白RNRS1，并与已报道的、和为等位基因，但突变位点不同，且在表型和农艺性状上存在差异。从表型上来看，、和突变体从苗期至抽穗期叶片均显示白条纹性状，突变体叶片从4叶或5叶期至分蘖期表现白条纹，抽穗后恢复，农艺性状上，抽穗后期与野生型无显著差异；、和均显示出株高、穗长、千粒重降低的表型，推测突变可能不影响核糖核苷酸还原酶结构域的功能，该突变位点可利用基因编辑技术应用于水稻育种。此外，和由粳稻品种突变得到，未显示白穗表型，而和由籼稻品种突变而来，显示明显的幼穗白化。为了解释这一现象，我们观察F2定位群体中条纹和白穗表型情况，发现抽穗期幼穗白化与叶片条纹性状是紧密连锁的，初步排除籼粳遗传背景的影响；()基因在中花11和9311的幼穗和幼叶中表达差异明显(图7)，暗示该基因突变后在籼粳之间的表型差异可能受其自身表达的影响；在9311的幼穗和幼叶中表达水平明显高于中花11(图7)，其在粳稻背景下的表达水平低于[5]，但在籼稻中的表达明显高于(图7)，这些数据说明在籼稻与粳稻中行使的功能可能存在较大差异，可能与籼粳之间基因突变造成的表型差异有关。在突变体中表达明显高于野生型，而在突变体中表达明显低野生型(图7)，这与Yoo等[5]研究结果一致。

()在茎基部组织中高度表达，说明其在叶绿体发育第一阶段，即质体分化和质体DNA合成中行使重要功能，突变体中dNTPs水平明显低于野生型，表明中质体DNA合成受阻[5]。突变体中幼穗白化，说明在幼穗发育早期发挥作用，该基因突变可能阻碍幼穗中质体DNA的合成，进而抑制叶绿体的分化，降低叶绿素水平。叶绿素合成相关基因在中受到不同程度调控(图6-A)，暗示可能参与调控叶绿素合成网络；叶绿体发育第一阶段和第二阶段相关基因表达上调(图6-B)，说明叶绿体发育受调控；编码光系统Ⅰ和Ⅱ复合体亚基的基因在突变体中表达明显下调(图6-C)，暗示中光合作用可能受到抑制，影响农艺性状，降低产量可能与此有关。本研究对于探索相同基因不同等位突变在不同遗传背景下行使不同功能的原因具有重要意义。

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Mapping and Mutation Analysis of Stripe Leaf and White Panicle Genein Rice

ZHOU Kunneng, XIA Jiafa, MA Tingchen, WANG Yuanlei, LI Zefu*

(,//-,,;*Corresponding author,-:.)

【Objective】Cloning and function analysis of chloroplast development-associated genes will lay a molecular basis for clarifying chloroplast function. 【Method】A stripe leaf and white panicle mutant,, was isolated from an ethylmethylsulfone (EMS) mutagenic population ofrice cultivar 9311. The phenotypic characteristics ofwere analyzed by pigments determination and agronomic traits observation. Thegene was identified by map-based cloning method. The gene expression was analyzed by the quantitative real-time PCR.【Result】Themutant showed stripe leaf phenotype from two-leaf stage to heading and white panicle after heading accompanied by obviously decreased pigment contents compared with wild type. Themutant was also featured with delayed heading and decreased plant height and yield and so on. Genetic analysis demonstrated that the mutant phenotype was controlled by a recessive nuclear gene. Thegene was fine-mapped to a 0.91 Mb interval between markers C6-4 and N14 on the short arm of rice chromosome 6. Sequence comparison displayed that a single nucleotide substitution (G776A) in the coding region of ribonucleoside-diphosphate reductase small chain(RNRS1), which led to the amino acid change from Gly to Asp. Thewas allelic to,and. We analyzed the mutant sites and phenotypes of the four alleles and summarized the effect of mutation on plant phenotypes and the difference betweenand. In addition, expression analysis revealed that genes involved in chlorophyll biosynthesis were differently regulated, genes involved in the first and second steps of chloroplast differentiation were up-regulated, and genes involved in photosynthesis were down-regulated. 【Conclusion】We analyzed the effect of mutant sites in() gene on rice phenotypes. It deepens understanding forfunction and help to elucidate the molecular mechanism of chloroplast development.

rice (); mutant;mutation analysis; expression analysis

Q343.5; Q754; S511.01

A

1001-7216(2018)04-0325-10

2017-09-28;

2018-01-14。

安徽省农业科学院科技创新团队项目(18C0101)；安徽省农业科学院学科建设项目(17A0103)；国家863计划资助项目(2014AA10A604-17)；国家重点研发计划资助项目(2016YFD0100101-06; 2017YFD0100406)。

10.16819/j.1001-7216.2018.7122