结直肠癌KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因联合突变分析及临床意义

梁跃 李光学 马庆庆

摘要 目的：探讨结直肠癌组织KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因突变情况及与临床病理特征的关系。方法：采用荧光定量PCR法检测结直肠癌58例组织中KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因突变情况。结果：检测到结直肠癌组织基因突变33例（56.90%），其中KRAS基因突变17例（29.31%），突变类型6种；NRAS基因突变1例（1.72%》，为G12D突变；PIK3CA基因突变9例（10.52%》，皆为H1047R突变；BRAF基因突变6例（10.34%），皆为V600E突变。PIK3CA仅与KRAS基因发生双突变4例。KRAS野生型患者中PIK3CA基因突变4例。KRAS基因突变与病理分期有关。结论：结直肠癌临床检测中对KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF多基因突变进行分子检测，能更准确地预测患者耐药情况，可正确指导临床用药和科学选择治疗方案。

关键词 结直肠癌；KRAS； NRAS； PIK3CA； BRAF；基因突变

结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤。最新数据统计显示，结直肠癌发病率居全球第3位，病死率居第4位[1]。目前化疗是结直肠癌最主要的治疗手段之一，然而近年报道结直肠癌化疗的有效率仅30%[2]。目前对于结直肠癌的治疗已进入了靶向治疗时代，靶向治疗药物作用主要靶点之一是表皮生长因子受体（EGFR），EGFR与血管生成、肿瘤细胞增殖、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关，其下游信号转导通路主要有Ras/Raf/MEK/ERK-MAPK和PI3K/Akt/mTOR通路，抗EGFR抗體能阻断其下游信号通路传导，从而发挥抗肿瘤的作用。常用靶向药物为EGFR的单克隆抗体西妥昔单抗和帕尼单抗。近年的研究表明，只有野生型KRAS基因患者才对抗EGFR单克隆抗体治疗有效，而突变型的患者无效[3-5]。这表明EGFR下游信号通路中的其他基因突变可能导致结直肠癌患者无法受益[6]。因此，检测与分析结直肠癌患者的KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA等多基突变，能更准确地预测患者用抗EGFR单抗药物的疗效。本研究采用实时荧光定量PCR法（qRT-PCR）对58例贵州省内结直肠癌病灶组织中的KRAS、BRAF、NRAS、PIK3CA 4个基因位点进行检测，分析基因突变情况，探讨其临床意义，指导结直肠癌的临床个体化治疗，为贵州省个体化靶向治疗结直肠癌提供依据。

资料与方法

2015年10月-2017年6月收集结直肠癌石蜡包埋标本58例，男27例，女31例；年龄20-72岁，平均（45.52±1.25）岁。记录已确诊结直肠癌患者的年龄、性别、吸烟、饮酒、高血压等一般疾病信息。

试剂与仪器设备：FFPE样品DNA分离试剂盒，人类KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因突变联合检测试剂盒，Nanodropl000微量核酸测定仪，ABI7500荧光定量PCR仪等。

方法：①提取石蜡切片DNA：取2-5片10μm的组织切片，利用二甲苯脱蜡，经离心处理后，取上清液加入1mL无水乙醇，震荡离心后静置沉淀，使用FFPE样品DNA分离试剂盒，按照说明书步骤进行组织切片DNA的提取。DNA微量分光光度汁测定所提DNA的浓度及纯度（OD260/OD280）。②实时荧光定量PCR扩增：以调整合适浓度的DNA为模板，使用人类KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因突变联合检测试剂盒，在荧光定量PCR仪中进行实时荧光定量PCR扩增，检测KRAS基因第2、3、4外显子、NRAS基因第2和第3外显子、PIK3CA基因20号外显子和BRAF基因15号外显子的热点突变，记录各样本KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF4个基因突变情况。

统计学方法：本次研究中所有数据均采用SPSS 20.0统计软件进行处理，计量资料采用（x±s）表示，计数资料采用率（%）表示，应用χ₂检验比较KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因突变率在不同年龄段、性别、肿瘤部位、淋巴结转移、病理分期差异是否存在统汁学意义，P<0.05表示差异有统汁学意义。

结果

KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因突变情况：选取结直肠癌组织58例，共检测基因突变33例（56.90%），KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因突变具体情况，见表1。

PIK3CA与KRAS基因出现双突变4例，分别为H1047R与G12D双突变3例，H1047R与G12V双突变1例，双突变占突变总数的12.12% （4/33），占PIK3CA突变的44.44%（4/9）。此外本研究未发现其他双突变或三突变。

KRAS基因野牛型中NRAS、PIK3CA、BRAF基因突变情况：41例KRAS基因野生型病例中NRAS基因突变0，PIK3CA基因突变4例，约占9.76%（4/41），BRAF基因突变0。

讨论

近年在结直肠癌临床治疗中采用靶向治疗取得了较好效果，目前常见靶向药物为EGFR抑制剂西妥昔单抗和帕尼单抗等，EGFR信号通路在肿瘤的发生、发展中具有十分重要的作用，EGFR与其配体结合后，对下游的与细胞增殖、分化及凋亡、迁移等有密切关系的Ras/Raf/MEK/ERK-MAPK和PI3K/Akt/mTOR信号通路进行激活。KRAS、NRAS和BRAF同属RAS-RAF-MAPK信号通路。KRAS、NRAS同属RAS家族，国内外报道KRAS基因突变率30%-40%，且常见突变发生在2号外显子的第12、13位密码子。NRAS基因报道相对较少，国内外研究发现CRC患者中NRAS基因突变率1.9%-3.9%。而作为RAF基因家族中的一员的BRAF，BRAF基因也是对西妥昔单抗和帕尼单抗耐药的独立影响因素，国内外研究报道的BRAF基因突变率1.8%-9.0%。本研究检测出贵州省KRAS基因突变17例（29.31%），仅NRAS突变1例（1.72%），BRAF基因突变6例（10.34%）。KRAS突变主要发生在第12位密码子上（14例，82.35%），未检测到双突变或三突变，在6种突变类型中G12D突变率最高[8例（47.06%）]；NRAS基因突变为G12D突变1例；BRAF基因突变皆为V600E突变6例。PIK3CA和KRAS基因突变可同时存在于同一癌组织标本中，而且KRAS野生型患者抗EGFR治疗失败可能有PIK3CA基因发生突变的原因。本研究检测到PIK3CA基因突变9例（15.52%），皆为H1047R突变，PIK3CA与KRAS基因之间发生双突变4例，结果与国内外报道基本一致。另外，KRAS基因野生型患者中发生PIK3CA基因突变4例，因此这部分KRAS野生型患者对抗EGFR药物会产生耐受。

综上所述，贵州省结直肠癌患者以KRAS基因突变率最高，PIK3CA、BRAF、NRAS基因突变较少见，PIK3CA和KRAS基因之间会交叉突变，而KRAS、NRAS和BRAF基因3者间基本不存在交叉突变；KRAS野生型患者耐药可能由于PIK3CA基因突变。突变患者将不能从抗EGFR的靶向治疗中获益，建议结直肠癌患者在用靶向治疗药物（如西妥昔单抗等）之前应先对结直肠癌患者进行KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA等多基因检测，掌握基因的突变情况，正确选择抗EGFR单抗药，进行最有效的分子靶向治疗。