广西姑婆山野生柑橘资源花粉形态观察及其系统分类学研究

唐 艳，武晓晓,2，刘冰浩，陈传武，牛 英，邓崇岭*

(1 广西特色作物研究院，广西柑橘生物学重点实验室，广西桂林541004；2 广西师范大学 生命科学学院，广西桂林541004)

宽皮柑橘是中国栽培分布最广、资源最丰富的一个柑橘类群，在柑橘演化、分类上具有十分重要的地位。Barrett 等[1]指出，在柑橘亚属中只有3个真正的种，即枸椽(C.medica)、柚(C.grandis)和宽皮橘(C.reticulata)，其他重要的栽培柑橘种类为杂种起源。20世纪80 年代前柑橘学术界普遍认为，宽皮柑橘近缘野生种只有印度野橘(C.indica)和立花橘(C.tachibana)2种[2]，而中国是否存在宽皮柑橘的近缘野生种，是国际柑橘学术界十分关注的问题。中国柑橘工作者对此作了大量调查研究工作。20世纪50～60年代以来，湖南、广西等地开展了多次柑橘资源普查，在湖南道县、宜章县、江永县及广西贺州市(原贺县)等地先后发现了道县野橘、莽山野柑、姑婆山野生皱皮柑和姑婆山野生元橘等野生柑橘，这些野生材料的发现有利于了解柑橘的起源、亲缘关系和遗传演化规律。

广西地跨北热带、南亚热带和中亚热带，地质起源古老，地形地貌十分复杂，北有南岭山脉，西临云贵高原，境内六万大山、九万大山连绵数千里，多山多雨的独特地理环境孕育了丰富的柑橘种质资源。1963～1964年，曾勉及叶荫民先后在广西进行柑橘考察时，对贺州市(原贺县)姑婆山的野橘进行了现场鉴定，暂定名为元橘(SinocitruschuanaTseng)[3]；石健泉于1978年和1984年2次到姑婆山一带进行考察，对姑婆山野生元橘的分布、生存的生态环境以及形态特征进行了分析[3]；石健泉最后根据调查结果，将姑婆山野生元橘分为皱皮柑和元橘[4]；邓崇岭等[5]对姑婆山野生皱皮柑和野生元橘进行了复查，并从地理分布、生境和形态特征方面进行了分析，认为姑婆山野生皱皮柑和野生元橘可能是柑橘属中的新类型。

柑橘是世界最重要的经济作物之一，柑橘的分类一直受到国内外学者的广泛关注,但至今都没有一个权威的、完整的柑橘分类系统。植物花粉有其独特的外形、复杂的外壁结构和精细的纹饰，并且在遗传中具有相对较强的保守性和稳定性，这对植物种和品种的鉴定具有重要的意义。基于此，本研究利用花粉形态特征对姑婆山野生皱皮柑和野生元橘进行分析，为其遗传演化、分类地位以及亲缘关系的鉴定提供参考依据[6]。

1 材料和方法

1.1 材料与处理

试验所用的姑婆山野生皱皮柑、姑婆山野生元橘和部分试验材料的花粉采自广西特色作物研究院资源圃，其余材料的花粉采自中国农科院柑桔研究所(重庆)，共计28份材料(表1)。

于盛花期选择健壮植株，采集树冠外围中上部含苞待放的花蕾，用消过毒的镊子去掉花瓣和花萼，只留花药，置于烘箱内37 ℃烘24 h以上，将获得的花粉放置于干燥管中低温保存。

1.2 测定项目及测定方法

1.2.1花粉电镜扫描观察用牙签挑取少量花粉，均匀撒在粘有导电胶的样品台上，用离子溅射仪进行真空喷金镀膜，置于FEI Quanta 200场发射环境扫描电镜下进行观察，工作电压为5 kV,选择有代表性的清晰视野进行观察，并拍照保存，800倍观察花粉的整体效果，6 000倍观察花粉的极面和赤道面，24 000倍观察花粉的外壁纹饰特征，并测量极轴长(P)、赤道轴长(E)、网脊宽度(W)以及网眼直径(D)的大小。花粉描述参照Walker[7]的研究方法。

1.2.2花粉定量特征的测量及统计每份试验材料随机选取20粒花粉粒进行相关数据的测量和统计，用SPSS软件计算平均值和标准差；选取赤道轴长、极轴长、网眼直径、网脊宽度、极轴赤道轴比值和网眼网脊比值共6个定量特征，用NTsys-pc软件将数据标准化后进行聚类,聚类单元之间的遗传距离以平均分类距离计算，聚类图选用UPGMA法。

2 结果与分析

2.1 花粉的外形大小

姑婆山野生皱皮柑花粉以单粒形式存在，中等大小，存在4条孔沟，花粉粒形状为长球形，极轴长度为(35.24±1.94)μm，赤道轴长度为(20.39±1.35)μm，P/E均值为1.73(表1)，极面观为四裂圆形，赤道面观为长圆形。姑婆山野生元橘花粉都以单粒形式存在，中等大小，存在4条孔沟，花粉粒形状为长球形，极轴长度为(30.21±1.14)μm，赤道轴长度为(22.12±1.97)μm，P/E均值为1.37，极面观为四裂圆形，赤道面观为长圆形(图版Ⅰ、图版Ⅱ)。

2.2 花粉的外壁纹饰

姑婆山野生皱皮柑和姑婆山野生元橘的外壁纹饰均为网状纹饰，即由凸起的网脊和网眼组成，网眼和保卫网眼的一半网脊形成一个网胞。但是两者网脊的宽窄、网眼的形状、大小存在差异。姑婆山野生皱皮柑网眼较大，形状为不规则圆形或多边形，网眼直径为(1.65±0.09)μm，网脊较狭且突出，宽度为(0.51±0.10)μm。姑婆山野生元橘网眼较小，形状多为圆形或近圆形，网眼直径为(0.86±0.08)μm，网脊平宽光滑，宽度为(0.47±0.09)μm(图版Ⅲ)。

2.3 聚类结果分析

利用NTsys软件对花粉6个定量特征进行聚类分析，在遗传距离0.827处，将试验材料分为9个组群(图1)

第Ⅰ组为罗浮金柑，单独成一组；

第Ⅱ组为道县野橘，单独成一组，在遗传距离1.20处，道县野橘和罗浮金柑聚为一组；

第Ⅲ组为23号枳，是枳属品种，单独成一组；

第Ⅳ组包括金刀峡宜昌橙和红河大翼橙，网眼略大，网脊较窄，网眼不规则。

第Ⅴ组包括8、11、12、13、14、18、21、25、26、27、28共11个品种，该组材料主要为柑橘属，其中姑婆山野生元橘在遗传距离0.07处与岑溪酸橘聚为一组，在遗传距离0.10处又和印度酸橘聚为一组(图1)；

第Ⅵ组包括10、16、17、19、20、22、23、24共8个品种，该组主要为橘类。

第Ⅶ组为沙田柚，单独成一组；

第Ⅷ组包括莽山野柑(尖叶)、莽山野柑(圆叶)，该组品种主要特点为网眼较大，网脊较狭并且突出。其中在遗传距离0.261处莽山野柑(尖叶)与莽山野柑(圆叶)聚为一组(图1)，是最特别、最原始的野生柑橘。

第Ⅸ组为姑婆山野生皱皮柑，网眼较莽山野柑小而网脊较宽，且在遗传距离0.976处与莽山野柑(尖叶)、莽山野柑(圆叶)聚为一组。

3 讨 论

姑婆山野生皱皮柑花粉的网眼比较大，网脊狭且突出较高，与莽山野柑尖叶[8]、莽山野柑圆叶的花粉形态相近，与刘庚峰等[9]对宽皮柑橘野生种花粉形态研究的结果一致；柑橘花粉形态进化途径通常为：较原始柑橘的花粉均为大型，网眼大，网脊比较窄，较进化的柑橘花粉为小型，网眼小，网脊较宽[9-11]，由花粉形态相近推测姑婆山野生皱皮柑与莽山野柑一样可能为柑类的原始种，也可能是柑橘属中的新类型，这与邓崇岭等[5]对广西贺州姑婆山野生柑橘资源复核调查的结果一致；姑婆山野生皱皮柑在遗传距离0.92处与莽山野柑尖叶、莽山野柑圆叶聚为一组，说明三者有一定的亲缘关系，结果与刘冰浩等[12]对广西地方柑橘资源ISSR分析分子标记的结果一致；王福生等[13]应用cpSSR 和EST-SSR 标记进行柑橘特异种质资源遗传背景研究中，聚类分析莽山野柑均与元橘聚为一组，经过试验材料的核对，研究中的元橘实为姑婆山野生皱皮柑，因此本研究试验结果与此相一致。聚类分析结果表明，莽山野柑(尖叶)和莽山野柑(圆叶)先聚在一起，然后与姑婆山野生皱皮柑聚为一类，在遗传距离1.64处才与枳属、金柑属及柑橘属的其他类型聚在一起，具有独立的、特别的原始性，不属于柑橘属中的宽皮柑橘、柚、橙和枸椽等种类，且花粉特征原始，推测莽山野柑(姑婆山野生皱皮柑)应该为柑橘属内独立的一个种，是除枸椽(C.medica)、柚(C.grandis)和宽皮柑橘(C.reticulata)外的第4个真正的种，或者有可能是除枳属、金柑属和柑橘属外的一个独立属。与钟广炎(未发表资料)认为莽山野柑不应当视为宽皮柑橘，而应该是一个独立的柑橘属种的观点基本一致[14]。也与Guohong Albert Wu等[15]的最新研究结果基本一致。当然，如要明确莽山野柑(姑婆山野生皱皮柑)是一个真正的种或者独立的属，则需进一步结合分子标记技术及基因组学等的研究加以确定。

表1 试验材料以及花粉电镜扫描形态特征

姑婆山野生元橘的网眼较小，网脊平宽光滑，与岑溪酸橘、印度酸橘的花粉形态相近，与刘庚峰等[9]

图1 基于花粉形态的柑橘资源聚类图Fig.1 Dendrogram of cluster analysis for citrus germplasm based on pollen morphology

研究宽皮柑橘野生种的花粉形态认为元橘与道县野橘的花粉形态比较相近的结果不一致；石健泉对姑婆山野生元橘进行了调查，从主要的植物性状分析，元橘与道县野橘很相似，认为这些性状可能是出自同源祖先的一群个体[3]；刘冰浩等[12]对广西地方柑橘资源ISSR分析的聚类显示，姑婆山野生元橘与道县野橘、立花橘聚为一组，认为姑婆山野生元橘与道县野橘有一定的亲缘关系。本研究中通过花粉形态特征比较及聚类分析得出的结果与以上研究结果不一致，姑婆山野生元橘与道县野橘相比，网脊较窄而网眼较大，推测姑婆山野生元橘比道县野橘更具有原始性，可能是宽皮柑橘区中最原始的野生类型。而道县野橘却演化成为一独特的种类，能单独为一组,但在遗传距离1.20处与罗浮金柑聚为一组，似乎存在某种亲缘关系，有待进一步分析研究。施文格(Swingle W.T)和田中长三郎(Tgozoburo Tanaka)都认为立花橘(C.tachibana)是宽皮柑橘近缘野生种，从花粉粒大小、网脊宽度、网眼直径分析结果表明：姑婆山野生元橘比立花橘要更原始。

柑橘大多数种是无融合生殖的，根据花粉对柑橘进行分类具有更重要的意义，花粉大小、网眼大小、网脊状况是区分柑橘分类群的重要特征[16]。花粉外壁纹饰特征受外界条件影响不大，而花粉的形状和大小受试验条件的影响较大。本研究中花粉形态特征对姑婆山野生皱皮柑和姑婆山野生元橘的起源、分类及亲缘关系的鉴定提供了一定的依据，但需进一步结合解剖学、细胞学、基因组学等方面的研究进行更加深入的研究。

图版Ⅰ 实验材料花粉形态扫描电镜赤道面观察结果(×6 000)
1～28 对应品种名见表1
Plate Ⅰ SEM observation results of the experimental materials on equatorial view(×6 000)
1-28. The corresponding varieties are shown in Table 1

图版Ⅱ 实验材料花粉形态扫描电镜极面观察结果(×6 000)
1～28对应品种名见表1
PlateⅡ SEM observation results of the experimental materials on polar view(×6 000)
1-28. The corresponding varieties are shown in Table 1

图版Ⅲ 实验材料花粉形态扫描电镜花粉外壁纹饰观察结果(×24 000)
1～28对应品种名见表1
Plate Ⅲ SEM observation results of the experimental materials on pollen exine ornamentation(×24 000)
1-28. The corresponding varieties are shown in Table 1