荷斯坦牛BoLA-DRA基因外显子1生物信息学分析

付保强，虎红红，刘丽霞

（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030)

主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex，MHC）是动物机体中紧密连锁的不平衡的基因复合体[1]，其在机体免疫应答、抗原识别和机体调控中发挥着重要作用[2]，编码产物为MHC抗原分子，与动物机体免疫疾病存在紧密联系性[3-6]。Acosta-Rodrguez等[7]于2005年报道了牛MHC并将其命名为牛白细胞抗原系统（Bovine lymphocyte antigen，BoLA）。荷斯坦牛BoLA基因位于牛的23号染色体上，主要是由三类基因组成，分别为Ⅰ类分子、Ⅱ类分子和Ⅲ类分子，其中Ⅱ类分子主要为异源双体膜糖蛋白，其被划分为Ⅱa、Ⅱb两个亚区，DRA是Ⅱ类分子Ⅱa亚区的基因，为MHC分子进行编码，具有高度多态性[8-11]。由于荷斯坦牛BoLA-DRA能够引起抗原抗体反应降低牛乳房炎等免疫疾病的发生，使其成为了荷斯坦牛抗病力的良好分子候选基因之一。近年来，研究者对荷斯坦牛BoLA基因的功能、多态性及其与免疫功能和疾病的相关性做了大量研究，高树新（2005）[12]通过对不同牛BoLA基因研究发现其具有高度多态性且对奶牛乳房炎具有致病性。王兴平（2004）[13]通过对四种黄牛为研究采用PCR-RFLP和SSCP方法，结合克隆测序分别研究了MHC的DRA基因第二外显子和DRB3基因第二外显子的分子遗传变异，并运用最小二乘线性模型，对所发现多态位点与牛的生产性状进行了相关分析，结果发现其与牛的生产性能高度相关。楚秋霞等（2013）[14]通过运用生物信息学对南阳牛BoLA-DRA编码蛋白区的理化性质和结构特征进行分析，结果发现DRA基因与其他物种核苷酸序列的同源性均在90%以上，进一步表明该基因与疾病性状存在相互作用关系。李彦清等（2015）[15]在对牦牛和普通牛BoLA-DRA*Exon2-intron2多态性分析比较后发现牦牛DRA基因第2外显子区碱基序列与普通牛以及山羊的同源性最高，系统进化情况与它们亲缘关系远近一致。这些研究都表明BoLA-DRA基因在控制机体免疫调控方面具有重要作用，但是前人对BoLA-DRA基因大多数研究主要集中在外显子2以及其他内含子，但是对于荷斯坦牛BoLA-DRA基因中1～93位的外显子1生物信息学研究未见报道。

本研究以荷斯坦牛为研究对象，通过构建DNA混合池，扩增后对其进行测序的方法对荷斯坦牛Bo-LA-DRA基因外显子1进行生物信息学分析，旨在为研究该基因理化特性、结构功能、免疫调节机制提供必要的理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集和DNA混合池的构建本研究血样采自宁夏农垦贺兰山奶业有限公司，从300头处于泌乳期荷斯坦牛中用医用采血管尾静脉采血10 mL，利用传统的酚-氯仿抽提法荷斯坦牛血液总基因组DNA[16]，-20℃保存备用。用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取效果，随机抽取30个效果良好的样品各取1 μL构建DNA混合池。

1.2 引物设计和PCR扩增测序根据NCBI数据库中荷斯坦牛BoLA-DRA基因序列（GenBank:M30120.1），利用在线软件Primer-BLAST对荷斯坦牛BoLA-DRA基因外显子1设计1对的特异性引物，在BoLA-DRA基因中处在1～93位的外显子1预期扩增片段长度为161 bp，引物序列分别为：F1:5'-CACCAAAGAAGAAAA TGGCC-3',R1:5-CCACAGTTCATTTCTCCGAAGC-3'上引物序列设计好后送至苏州金唯智生物科技有限公司完成。PCR扩增体系20 mL：DNA模板0.8 μL，上、下游引物各0.4 μL，2×Power Taq PCR Master Mix 11 μL，ddH2O 7.4 μL。PCR条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，57.6℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30个循环；72℃延伸10 min，4℃保存，扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行检测，紫外分光光度计检测。将扩增产物进行回收纯化后，送至苏州金唯智生物科技有限公司进行PCR产物测序。

1.3 生物信息学分析软件通过对荷斯坦牛BoLADRA基因外显子1扩增产物的序列测序，运用RNA fold web server在线服务器（http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）预测mRNA二级结构，运用软件（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sop ma.html）预测蛋白质的二级，利用Protfun在线软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/）分析预测蛋白质的功能。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果荷斯坦牛基因BoLA-DRA外显子1 PCR扩增产物片段大小在160 bp左右，预期目的片段长度大小相符，且条带明亮清晰、特异性良好，如图1所示。2

图1 荷斯坦牛基因BoLA-DRA外显子1 PCR扩增结果Fig.1PCR amplification Results of BoLA-DRA exon 1 in Holstein gene

2.2 测序结果分析通过对荷斯坦牛DRA外显子1基因进行测序分析发现，存在1个插入位点（exon1-1T^2）测序峰图如图2和3所示。

图2 荷斯坦牛DRA基因外显子1测序峰图Fig.2The sequence peak diagram of exon 1 of DRA gene

2.3 mRNA二级结构预测结果通过运用在线软件对荷斯坦牛DRA外显子1插入位点mRNA二级结构进行预测，结果如图4所示，发现外显子1碱基插入之后自由能与突变前相同，该插入没有改变DRA外显子1mRNA的二级结构如图4所示。

图3 测序结果序列与基因库序列比较图Fig.3 Comparison chart of sequencing result sequence and gene pool sequence

图4 荷斯坦牛DRA基因外显子1 mRNA二级结构图Fig.4 Exon 1 mRNA secondary structure of the DRA gene in Holstein

2.4 蛋白质的二级结构预测荷斯坦牛DRA外显子1的插位点为错义突变，因为外显子1在DRA基因序列的1～93位，但编码区只有15～93位点，插入位点不在编码区上，未造成氨基酸改变，突变前后蛋白质二级结构相同，同时也不会影响蛋白质的结构功能。预测结果显示，荷斯坦牛DRA外显子1蛋白质二级结构由α-螺旋（30.77%）、β-折叠（34.62%）、β-转角（11.54%）、无规则卷曲（23.08%）组成，其中β-折叠占比例最高。

2.5 蛋白质的功能预测与分析荷斯坦牛DRA外显子1从预测结果可以看出编码蛋白质的荷尔蒙和免疫应答的含量相对较高，其几率分别为21.057和3.546，荷尔蒙的几率最高，免疫应答次之，据此可以推断荷斯坦牛DRA基因外显子1在牛的性激素和免疫应答过程中起着重要的作用。

3 讨论

MHC基因是指脊椎动物某一染色体上编码主要组织相容性抗原、控制细胞间相互识别、调节免疫应答的一组连锁的基因群，其具有高度多态性，与动物自身免疫疾病存在密切关系BoLA-DRA基因是奶牛MHC基因中的一个编码基因，目前国内对于BoLA-DRA基因的研究主要集中在DRA基因的多态性上分析上，蒲兰屏等（2012）[17]通过运用生物信息学对比不同牛的基因，发现与MHC家族其他基因不同DRA基因在所有的动物尤其是反刍动物中表现出高度保守，包括肽结合部位（PBS）、N-糖原区、α1、α2区等功能部位都呈现出高度保守。高树新等（2008）[18]发现两种兼用型在研究DRA外显子2时发现在感染乳房炎牛中CC基因型频率最高，在健康牛中BC基因型频率最高，结果表明牛乳房炎抗性和易感性可能与牛的基因型有密切关系。前人对于外显子1的研究还未见报道，本研究主要对荷斯坦牛BoLA-DRA外显子1的扩增产物经过测序发现在第一位碱基C和第二位碱基A之间有碱基T的插入，但是没有影响mRNA的二级结构的变化，并且在发生突变前后自由能的大小相同，出现的原因可能是因为此碱基的插入为错义突变，但因为插入位点不在编码区，不会引起氨基酸结构功能以及蛋白质结构功能的变化，所以对于荷斯坦牛BoLA-DRA基因外显子1高级结构和功能未发生变化。功能预测结果表明，该基因可能在荷尔蒙的产生和免疫应答过程中起着重要的作用，研究结果可为荷斯坦牛BoLA-DRA基因外显子1功能的研究提供科学理论依据。

表1 荷斯坦牛DRA基因外显子1蛋白质的功能预测与分析Table 1 Functional prediction and analysis of exon 1 protein in Holstein DRA