盘锦地区候鸟禽流感调查研究

印宝东，杨 曼，温书志，李 红，李 雪，张 彬，王丽杰，刘 野

（1.辽宁省盘锦市动物疫病控制中心，辽宁 盘锦 124013；2.辽宁省盘锦市盘山县动物疫病预防控制中心，辽宁 盘山 124100；3.辽宁省盘锦市盘山县电商物流产业管理中心，辽宁 盘山 124100；4.辽宁省盘锦市大洼区动物疫病预防控制中心，辽宁 盘锦 124200；5.辽宁省盘锦市湿地保护管理中心，辽宁 盘锦 124013）

禽流行性感冒，简称禽流感（Avian Influenza，AI），是由A型流感病毒引发的以感染禽类为主的传染病，世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。鸡、火鸡、鸭、鹅和鹌鹑等家禽及野鸟、水禽、海鸟等均可感染禽流感病毒。野生鸟类是禽流感病毒的天然宿主，带毒候鸟可能随着迁徙将禽流感病毒传播到世界各地[2]。双台河口保护区湿地总面积8万公顷，丹顶鹤、黑嘴鸥等260多种鸟类在这里栖息、繁殖。在东亚至澳大利亚候鸟迁徙路线上起着重要中转站的作用[4]。多年来，本课题组密切关注双台子河口湿地迁徙、栖息的野生鸟类情况，通过持续监测候鸟携带禽流感病毒情况并对病毒开展分子流行病学分析，为寻找我国禽流感病毒传播规律提供数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 H5、H7、H9、A型流感病毒通用型荧光RT-PCR检测试剂盒购自凯杰（匹基）生物工程（深圳）有限公司，高速冷离心机为德国，荧光PCR仪购自美国、生物安全柜为德国、移液器为美国，离心管、移液器枪头等常规耗材为进口。

1.2 样品采集根据辽河河口自然保护区整个调查范围内的具体地貌、地势和湿地分布情况，将样品监测采集范围划分为15个具有明显可识别边界的小区（见图1）。在每个监测小区中，选择一处视野开阔的观察点，对监测范围内水禽进行逐一识别和统计、记录。样品采集对象为监测时段内所见到的所有自然界活动的野鸟，结合日常巡查针对捡拾死鸟尸体、合法捕获进行人工饲养的鸟类进行检测。随时到合法饲养舍采集棉拭样品和到候鸟集中栖息场所采集野鸟新鲜粪便样品。根据春秋季节本区鸟类迁徙的特点，春季监测时间主要集中在北迁雁鸭类、鹤鹳类和鸻鹬类迁徙高峰期，采样时间集中在2月底～5月底；秋季监测时间主要集中在南迁雁鸭类、鹤鹳类和鸻鹬类迁徙高峰期，采样时间在7月下旬～11月下旬；每月开展1次采样。采集的粪便或拭子样品放入含10%甘油的PBS缓冲液中。

图1 辽宁双台河口自然保护区监测区分区图[5]Fig.1Liaoning Shuangtaihekou natural reserve monitoring area partition diagram

表1 辽河口湿地样品采集点分布Table 1Liaohekou wetland Sample collection point distribution

1.3 样品检测

1.3.1 检测前样品处理采集的粪便或拭子样品保存管用振荡器充分震荡，让拭子或粪便充分与缓冲液混合，然后小型台式高速离心机12 000 r/min离心2 min，取上清用于样品核酸提取。

1.3.2 样品核酸提取 按照试剂盒说明书，每个样品取200 μL（同时设立阳性和阴性对照样品），加入600 μL裂解液，混匀，然后加入200 μL氯仿，混匀，4℃12 000 g离心15 min，取上清至另一个1.5 mL离心管中，加入400 μL的异丙醇，颠倒混匀。12 000 g离心15 min，弃上清，用600 μL 75%乙醇洗涤1次，离心弃上清，倒立离心管，自然烘干，每个样品加11 μL的无RNA酶的DEPC水溶解RNA沉淀。-20℃保存备用。

1.3.3 荧光定量PCR检测按照试剂盒说明书，在各设定的PCR管中分别加入上述样本处理中制备的RNA溶液各10 μL，盖紧管盖，将PCR管排好放入PCR荧光检测仪内，进行检测，RT-PCR循环参数如下：42℃30 min，92℃30 min，1个循环；92℃10 s，45℃30 s，72℃1 min，5个循环；92℃10 s，60℃30 s，40个循环。

1.4 阳性样品的病毒分离鉴定对实验室检测阳性的样品送到国家禽流感参考实验室进行病毒分离鉴定，病毒分离阳性的样品进行序列测定和分析。

2 试验结果

2.1 样品采集情况自2012年至2017年在双台子河口自然保护区的湿地、救助站内、苇田等区域采集了4 278份样品，其中野鸟样品棉拭384份、野鸟尸体脏器39份、环境水样500份、粪便3 355份，采集的样品存放于含有PBS甘油的缓冲液系统内，-20℃保存备用。

2.2 样品检测结果采用凯杰（匹基）生物工程（深圳）有限公司提供的荧光定量PCR检测试剂盒对提取的核酸进行检测，首先用通用型试剂盒检测样品中M基因的存在与否，来判定样品中是否含有禽流感病毒，检测结果发现在4 278份样品中有7份为流感监测阳性，分别用H5、H7和H9亚型禽流感检测试剂盒进行亚型鉴定发现这5个样品中有2个为H9阳性，2个为H5阳性，有1份样品该三种试剂盒为阴性。

2.3 阳性样品鉴定将该批检测阳性样品送到参考实验室进行检测，反馈结果表明：没有鉴定出亚型的样品为H6亚型禽流感病毒，对检测阳性的H5样品进行病毒分离鉴定发现为H5N8或H5N2亚型，共鉴定出1株H5N8病毒亚型，1株H5N2病毒亚型，H5亚型禽流感病毒进化分支为2.3.4分支，与韩国流行病H5N8毒株的HA基因相似性为99.5%，高度同源。

表2 2012～2017年不同时间监测野鸟禽流感阳性分布Table 22012～2017 different time surveillance of wild birds avian influenza positive distribution

3 讨论

双台河口保护区湿地作为多种野鸟的重要的栖息、繁殖地，同时也是世界上重要的候鸟迁徙带。该湿地区域是东亚至澳大利亚候鸟迁徙路线上的一个重要中转站，特殊的地理位置、良好的生态环境和特殊植被类型养育着丰富的动物资源，是多种鸟类的理想栖息繁殖地和迁徙停歇地。这里是世界上最大的黑嘴鸥繁殖地，分布有黑嘴鸥12 000余只，其繁殖种群10 000余只，是名副其实的“黑嘴鸥之乡”。众所周知，野鸟作为禽流感病毒的最大天然宿主库，在维持流感病毒的多样性方面起着重要的作用。随着候鸟的迁徙，禽流感病毒也随着感染的野鸟不断移动，并随着野鸟的生活活动以及粪便的排放而污染野鸟活动的区域环境，由于自然界中野鸟的活动区域和水禽的活动区域有着较大的重叠，容易导致病毒进入水禽。是当前家禽感染禽流感病毒的一个重要风险来源。

在盘锦市辖区范围内，水禽的饲养量较大，尤其是散养家禽较大，可以多达380万羽，给候鸟与家禽之间增加了一个较大的密切接触机会。韩国2014年前后连续多次发生禽流感疫情也表明，野鸟给该迁徙路线上的家禽带来巨大的禽流感感染风险。本研究通过对盘锦地区野生鸟类进行长达5年的禽流感监测发现，不同时间和季节，野鸟携带的禽流感种类也不尽相同，野鸟可以携带多种不同的病毒，也可能携带传播高致病性的禽流感病毒。通过对分离H5亚型禽流感病毒的HA基因的序列比较可以发现研究分离株的大多数基因与韩国毒株的亲缘关系较近,说明在韩国和中国之间流感病毒通过候鸟存在频繁的基因交流和交换。

从监测结果看，家禽H5病毒感染与候鸟之间可能存在一定关联，加强候鸟感染情况的调查与监测，对做好高致病性禽流感预警预报工作具有促进和指导作用。同时在家禽饲养管理方面应注意做好圈舍的密封防护，安装防鸟网设施，以及生物安全防隔离设施等，按程序做好免疫、定期开展消毒，严防病毒传给家禽。每年数十万只的野鸟于此停歇、栖息或繁殖，足以说明双台河口自然保护区在亚太地区野鸟保护上的重要位置，盘锦作为我国研究流感病毒传播的前沿阵地具有重要的代表性，对公共卫生安全也具有实际意义。