羊源雷氏普罗威斯登菌的分离鉴定

曹瑞勇，聂 鑫，李国华，杜 丽，王凤阳

（海南大学，海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室/海口市动物基因工程重点实验室，海南 海口 570228）

普罗威登斯菌（Providencia spp）是革兰氏阴性菌，属于肠杆菌科。包括产碱普罗维斯登菌（P.alcalifaciens）、雷氏普罗威登斯菌（P.rettgeri）、拉氏普罗威登斯菌（P.rustigianii）和斯氏普罗威登斯菌（P.stuartii）[1-2]。该菌是一种条件致病性的人畜共患病原菌，能引起腹泻、肠道外感染和尿道感染等疾病[3]。也属于人畜共患病病原，是可以污染食物造成中毒的食物伴侣菌，并且极易产生耐药性[4]。Williams G J等[5]曾从鳄鱼巨蜥的肺组织中分离到雷氏普罗威登斯菌；2017年芮萍等[6]对临床表现为腹泻仔猪，进行致病菌的分离鉴定，结果表明：该病原菌为雷氏普罗维登斯，并且耐药广泛。

本文从海南某黑山羊养殖场患病山羊鼻腔内分离到了该菌，为海南黑山羊疾病的诊断和治疗奠基了基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料 海南省某黑山羊养殖场黑山羊鼻腔分泌液。

1.2 主要试剂TSA、TSB培养基，购自美国BD公司；麦康凯琼脂培养基、生化鉴定管和生化鉴定试纸，均购自广东环凯微生物有限公司；DNA回收纯化试剂盒，购自Takara宝生物工程（大连）有限公司；2×Taq PCR MasterMix，D2000 marker，均购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 病料采集采集于海南某黑山羊养殖场病羊鼻拭子。病料采集前用75%酒精彻底消毒病羊的鼻孔周围，用一次性无菌棉签在鼻孔深处再次旋转以蘸取鼻腔分泌液，将棉签折断放于无菌试管中，于4℃保存，以备试验处理。

1.3.2 细菌分离培养 将采集的鼻拭子，放于无菌的生理盐水中，37℃剧烈震荡30 min，吸取0.2 mL加入到TSB液体培养基中，于37℃恒温培养18～24 h后作为增菌液。吸取适量的增菌液，做革兰氏染色。将增菌液接种于麦康凯培养基和TSA，37℃恒温培养18～24 h，观察菌落生长情况。在平板上挑取形态一致、优势的菌落，进行反复划线数次，纯化菌株。再挑取单个菌落经革兰氏染色，在光学显微镜下观察细菌的形态及染色特点。

1.3.3 生化反应特性参照姚火春等[7-8]的方法进行生化反应试验，参照试剂盒说明书操作后，在37℃恒温培养箱培养18～24 h，结果见表1。

1.3.416 S rRAN鉴定采用菌落PCR方法，用崔颖鹏等[9]设计的引物序列，为1 465 bp。

表1 引物序列Table 1Primer sequence

在离心管中加入300 μL无菌水，接种环菌苔至管中，振荡，沸水浴10 min，10 000 g离心5 min，取上清为模板[10]，PCR扩增16S rDNA，反应体系：10×Buffe 2.5 μL，dNTP各1 mmoL，Taq聚合酶1.5 U，上下游引物各 0.5 μL（0.2 μmoL），细菌DNA模板0.5 μL，加蒸水至25 μL；反应条件：94℃4 min预变性；94℃45 s、55℃45 s、72℃1 min，循环30次，72℃10 min修复延伸[11]。用凝胶成仪拍照保存。

2 结果和分析

2.1 细菌分析情况和革兰染色镜检结果在TSA平板上菌落呈表面光滑、边缘整齐的无色半透明圆形菌落；在麦康凯培养基上形成浅橙色菌落。挑取单一菌落进行革兰氏染色，用油镜观察。观察结果：革兰氏阴性、两端钝圆、球杆菌（如图1）。

图1 分离菌株的革兰氏染色Fig.1Gram stain of the isolated strain

2.2 生化鉴定结果将分离菌株按照生化鉴定管说明书操作完成，结果如表2。

表2 生化鉴定试验结果Table 2Biochemical identification results

2.316 SrRAN鉴定结果与鉴定PCR反应产物大小为1 465 bp，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。紫外灯下观察结果和试验预期结果一致（如图2）。

按照DNA回收纯化试剂盒方法回收纯化阳性PCR产物，送上海生工生物技术服务有限公司进行测序，测序结果在Nucleotide BLAST，与雷氏普罗威登斯菌（KC456547.1）同源性达到99%。

图2 16S rRNA扩增结果Fig.2 Amplification product of 16S rRNA

3 讨论

雷氏普罗威登菌（Providencia rettgeri）是革兰氏阴性菌，属于肠杆菌。在人上主要可致泌尿道感染和其他的肠道外感染。2006年卫生部把它列入人与人间传染的病原微生物名录。根据报道，食物在加工、运输、销售过程中很容易受该菌污染，引起食物中毒事件多有发生。本菌为腐败菌，耐低温，可以在低温储存的食品中存活，尤其是夏季天气炎热更易造成该菌的大量繁殖，造成食物腐败，人在食用该菌污染的食物后会出现食物中毒现象，国内报道，从肉类食品中分离到的雷氏普罗威登斯菌可能沿着食物链向人类传播，给人类生命安全造成很大威胁[12]。雷氏普罗威登菌是一种条件致病菌，可引起人和动物发病。1997年战文斌等[7]首次从国内发病的对虾中分离出该菌，并在实验室人工感染对虾成功，说明该菌对海水养殖动物有致病性。2001年，范红结等[13]从病鳖干酪样坏死的脏器中分离到雷氏普罗威登菌，用该菌接种健康鳖，引起发病死亡，证实该菌有致病性。

本试验在临床中通过对细菌的分离培养、细菌形态学、生化试验、分子生物学等技术手段，最终确定分离菌株为雷氏普罗威登斯菌。该菌可能因为天气突然变化、动物免疫力下降等原因感染动物，为临床疾病治疗提供了参考资料。为临床患呼吸道疾病、败血症、尿道感染、混合感染病羊的治疗提供了新的思路和方案，也给养殖人员敲响了人畜共患疾病风险的警钟。