分散固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中甲基睾酮的残留量

杨 霄，索纹纹，洪 波，李小玲，曾春芳，黄向荣，3

[1.湖南省水产科学研究所，湖南长沙 410153； 2.农业部渔业产品质量监督检验测试中心(长沙)，湖南长沙 410153；3.水产高效健康生产湖南省协同创新中心，湖南常德 415000]

甲基睾酮(methyhestosterone，简称MET)，别称甲睾酮、甲基睾丸酮、甲基睾丸素，是一种人工合成的雄性激素，具有雄性和蛋白同化双重作用，应用于水产养殖可以提高产量和控制性别[1-2]。甲基睾酮在动物体内代谢缓慢，极小的残留量都会对人体造成巨大的潜在危害，因此，多数国家已经禁止在动物养殖中使用此种激素，并要求动物源食品中不得检出该激素。2001年我国农业部实施的行业标准NY 5070—2001《无公害食品水产品中渔药残留限量》中，将甲基睾酮列为禁用药物。2003年农业部发布的235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中也规定甲基睾酮为禁用兽药。

目前，甲基睾酮的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[3]、高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)[4]以及酶联免疫法(ELISA)[5]等。HPLC前处理步骤较繁琐，分析时间长；ELISA容易出现样品假阳性，定量不准确，较适用于样品初筛；HPLC-MS/MS前处理较简单，灵敏度和特异性高，可用于甲基睾酮的准确定量。水产品中甲基睾酮的前处理方法多为传统的固相萃取[6-7]、超声提取-乙酸乙酯反萃取[8]、超声提取-乙醚反萃取[9]、磁力搅拌-液液分配[10]等，这些方法操作步骤较多，耗时长，不利于大批量样品的快速测定。分散固相萃取(Dispersive-SPE)净化法(QuEChERS)，是由美国的Lehotay和德国的Anastassiadas于2003年提出的一种快速、简单、便宜、有效、可靠和安全的样品前处理技术，该技术直接将吸附剂粉末加入提取液中进行净化，其操作简便快速，取样量少，廉价安全，适合批量样品的快速分析检测。本试验采用QuEChERS方法和HPLC-MS/MS技术，拟建立一种高效、快速的水产品中甲基睾酮残留量的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

本试验所用中华鳖、罗非鱼、凡纳滨对虾均购自长沙市水渡河农产品大市场。

TSQ Quantum Access液相色谱-串联质谱联用仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；FA25均质器(德国Fluko公司)；精密电子天平(Mettler Toledo公司)；高速冷冻离心机(日本日立公司)；漩涡振荡器(美国Fisher公司)。

甲基睾酮标准溶液：精确称取甲基睾丸酮标准品(纯度≥98%，德国Dr. Ehrenstorfer公司)5.0 mg，用甲醇溶解并定容至50 mL棕色容量瓶中，配成质量浓度为100 μg/mL的标准储备溶液，于-18 ℃保存，临用时稀释；甲酸(LC-MS级，美国Sigma公司)；乙腈(HPLC级，德国Merck公司)；N-丙基乙二胺(N-propylethane-1,2-diamine，简称PSA，百灵威科技有限公司)；C18吸附剂(70～230目，上海安谱科学仪器有限公司)；无水硫酸镁(MgSO4，分析纯，郑州益康化工产品有限公司)；试验用水为超纯水。

1.2 仪器分析条件

1.2.1 色谱条件 Atlantis C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，3.0 μm)；柱温为30 ℃；进样量为20 μL；流速为300 μL/min；流动相：甲醇+0.1%甲酸水溶液(体积比=70 ∶30)。

1.2.2 质谱条件 采用电喷雾离子源(ESI)，正离子方式检测；喷雾电压为4 000 V；扫描方式为选择反应监测(SRM)；毛细管温度为350 ℃；蒸发温度为300 ℃；鞘气压力为40(arbitrary unit)，辅助气压力为10(arbitrary unit)，碰撞气压力为199.983 mPa(表1)。

表1 甲基睾酮质谱采集参数

注：“*”标记的为定量离子。

1.3 样品前处理

水产品取可食肌肉部分，按照SC/T 3016—2004《水产品抽样方法》的规定处理后置于-18 ℃密封保存。使用前先解冻。

1.3.1 样品提取 准确称取(5±0.02) g处理后的样品于 50 mL 离心管中，加入10 mL乙腈，同时加入3.0 g无水硫酸镁，涡旋振荡提取1 min，6 000 r/min离心5 min，取上清液于鸡心瓶中。向下层残渣中加入10 mL乙腈重复提取1次，合并2次的上清液于鸡心瓶中。于40 ℃旋转蒸发至近干。

1.3.2 样品净化 在鸡心瓶中加入2 mL流动相充分溶解残渣，取1 mL复溶液转入装有50 mg PSA、150 mg C18吸附剂的5 mL离心管中，充分漩涡振荡2 min，10 000 r/min 离心5 min后，取上清液过0.22 μm聚四氟乙烯膜后上机测定。

1.4 校准曲线的绘制

将空白样品按照“1.3”节方法处理后，取适量空白上清液加入不同量的甲基睾酮标准储备液，配制成1、5、10、50、100、200 ng/mL的基质空白标准溶液，混匀后进样。以待测物提取离子流色谱图的峰面积为纵坐标、相应待测物质量浓度为横坐标进行回归运算，求得直线回归方程。

2 结果与分析

2.1 样品前处理方法的优化

2.1.1 样品提取溶剂的选择 本试验比较了甲醇、乙腈、乙醚、乙酸乙酯4种溶剂的提取效果。结果表明，以上4种溶剂对甲基睾酮的提取效率均较高，达到75%以上。甲醇能溶解大多数极性物质，乙酸乙酯提取的亲脂性化合物较多，二者共萃取杂质多，易造成基质干扰，而乙腈、乙醚样品提取液较清澈，基质干扰较小，且目标物周围无明显的杂质干扰峰，但乙醚易挥发、毒性大，对试验操作者影响大，故本试验选择毒性较小、挥发性低的乙腈作为提取溶剂。

2.1.2 无机盐用量的选择 水产品中含有不同量的水分，且水分与乙腈互溶，在目标化合物被乙腈提取的过程中部分水相分配到乙腈提取层，影响试验结果和下一步分离操作。因而需要加入合适的无机盐去除有机相的水分。本试验根据Schenck等的报道[11]，选用无水MgSO4作为除水剂。试验比较了不同量的无水MgSO4对除水效果的影响，结果发现，当无水MgSO4用量为3 g时可以有效除去水分，回收率较高；当无水MgSO4用量少于2 g时，不能完全除去有机相的水分，造成样品浓度稀释，导致回收率降低；当无水MgSO4用量为5 g时，过量的无机盐将目标化合物部分包埋，使待测物未完全进入乙腈提取相，从而降低了回收率(图1)。因此，本试验选用 3 g 无水MgSO4作为除水剂。

2.1.3 分散固相萃取条件的优化 样品经过乙腈沉淀蛋白质后已经去除了大部分的干扰物，但仍可能存在少量的色素、脂肪等杂质，为了提高净化效率和减少待测物的损失，本试验采用分散固相萃取的净化手段。PSA作为净化吸附剂可以除去样品基质中的少量极性色素、有机酸、酚类和糖类，C18吸附剂可以除去一些强疏水性干扰物(如脂肪)。由于鱼虾样品中含有大量的蛋白质、脂肪以及一些色素等干扰物质，所以本试验采用PSA和C18作为吸附剂进行分散固相萃取净化。本试验在5份1 mL空白鱼肉提取液中加入标准溶液后，再分别加入不同比例的PSA和C18，得到甲基睾酮的加标回收率。从图2可以看出，当PSA、C18质量比=100 mg/50 mg时，甲基睾酮的回收率最低，表明PSA对甲基睾酮有一定程度的吸附作用，因此可以适当降低PSA的比例。当PSA、C18质量比=50 mg/150 mg时，甲基睾酮的空白鱼肉提取液较清澈，甲基睾酮回收率在85%以上，说明该比例的PSA和C18对目标物的吸附少且可以很好地吸附脂肪、色素等杂质，样品提取液净化效果好。当C18的使用比例继续增加时，无明显效果，且随着吸附剂的增加，上清液的量逐渐减少，不方便移取，因此，本试验选取PSA、C18质量比=50 mg/100 mg作为分散固相萃取吸附剂的用量。

2.2 流动相的选择

流动相的组成影响目标化合物的峰型、保留时间及质谱的离子化效率[6]。液质联用的流动相组成为甲醇-水体系和乙腈-水体系。本试验选用甲醇和乙腈作为有机相，水、0.1% 甲酸水溶液、2 mmol/L乙酸铵水溶液、2 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%甲酸)作为水相，进行不同组合。结果表明，以甲醇和0.1%甲酸水溶液(体积比为7 ∶3)作为流动相组成时目标化合物的响应强度最大，峰型最尖锐，且目标化合物周围无明显杂质峰干扰。

2.3 质谱条件的优化

采用注射泵进样的方式，以5 μL/min的流速，将 500 ng/mL 甲基睾酮标准溶液注入离子源中，在正离子模式下对甲基睾酮进行一级质谱全扫描，得到分子离子，然后以分子离子为母离子对其子离子进行全扫描，以SRM模式进行检测。在此基础上对碰撞能等离子源参数进行优化，使选定的母离子和子离子组成的特征离子的丰度比例最佳。最终确定“1.2.2”节所述的质谱条件。

2.4 基质效应的消除

在液相色谱-质谱分析中，基质效应是客观存在的。基质效应影响测定结果的精密度和准确度。为了消除(或补偿)基质效应给分析结果带来的偏差，通常采用同位素内标，稀释样品溶液，配制空白基质标准溶液以及优化色谱-质谱条件等方法。本试验采用优化色谱-质谱条件和配制空白基质标准溶液来消除基质效应对检测结果的影响。

2.5 线性范围与检出限

在选定的色谱分离条件和质谱测定参数下，将6个浓度系列的甲基睾酮空白基质标准溶液上机测定，结果表明，在 1～200 ng/mL的质量浓度范围内，甲基睾酮的色谱峰面积与质量浓度呈良好的线性关系，线性回归方程为y=473 540x-132 48，相关系数为0.999 8。50 ng/mL甲基睾酮空白基质标准溶液SRM色谱结果如图3所示。采用空白样品添加低浓度的标准品，按“1.3”节方法进行前处理后上机测定，根据特征离子色谱峰的信噪比(S/N值)等于3为检出限，S/N值等于10为定量限，得到甲基睾酮的检出限为0.5 μg/kg，定量限为 1.0 μg/kg。

2.6 准确度与精密度

根据水产品各物种间肌肉成分的差异，如虾肉中的色素含量较高，中华鳖肌肉中脂肪含量较高等，选取罗非鱼、中华鳖以及凡纳滨对虾3类水产品的肌肉组织进行加标回收率试验。各个品种空白样品的添加标准物质的浓度为1、10、50 μg/kg，每个浓度水平作平行样品5个，计算回收率和相对标准偏差，结果见表2。4种样品的加标回收率为82.4%～96.3%，相对标准偏差为3.21%～6.98%，表明该方法的准确度高，重复性好，符合药物残留检测方法的要求。

2.7 实际样品测定

将建立的方法用于30份市售水产品(10份草鱼，10份罗非鱼，5份凡纳滨对虾，5份中华鳖)的检测，结果发现这30份市售水产品中均未检出甲基睾酮，说明上述市售水产品中未违规添加甲基睾酮。

表2 加标回收率及精密度试验结果

3 结论

本研究建立了分散固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中甲基睾酮残留量的方法。采用分散固相萃取技术，有机试剂用量少，样品前处理简单，易于操作；采用高效液相色谱-串联质谱检测，显著缩短了色谱分析时间，提高了灵敏度。该方法具有简单、快速、高效、环保的特点，适合当前水产品中甲基睾酮残留量快速检测的要求。