脾多肽对非霍奇金淋巴瘤患者浆细胞样树突状细胞功能及成熟的影响

凡治国,李志平,崔东海,任　超

(安阳市肿瘤医院普内科，河南 安阳 455000)

非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin’s lymphoma, NHL)是一种发生于淋巴造血系统的恶性肿瘤，B细胞来源者占85%以上，在恶性淋巴瘤中NHL所占的比例远高于霍奇金病[1]。青壮年人群是NHL的高发人群，近年来的流行病学资料显示其发病率和病死率逐年上升[2]。虽然放、化疗技术取得很大的发展，但由于NHL临床特征变化多样，病理类型又非常繁杂，故临床治疗仍存在很多难题[3-4]。免疫功能缺陷是NHL发病的高危因素之一，免疫调节异常可能在NHL的发生、发展中起重要作用。

浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cell，pDC)是体内专职性抗原呈递细胞(antigen-presenting cell，APC)，不仅激活初始型T细胞产生免疫应答，而且能启动T细胞介导的免疫应答，受细菌、病毒的刺激时产生一定数量的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白介素-6(interleukin-6，IL-6)，并逐渐向树突状细胞(dendritic cell，DC)分化，在机体免疫中起重要作用[5-6]。以DC为基础的主动免疫治疗在肿瘤治疗中受到人们重视，也成了目前研究的热点。脾多肽是由多肽、游离氨基酸、核酸和总糖组成的一种激活及增强机体免疫功能的药物，对机体免疫有双向调节作用，具有调节免疫、增强机体抵抗力、抗肿瘤及提高骨髓造血功能等作用。目前尚没有关于脾多肽对NHL患者pDC功能及成熟的影响的报道，本研究采用流式细胞仪分选pDC，用不同浓度的脾多肽刺激pDC，观察脾多肽对外周血来源的pDC功能及成熟的影响，以期为NHL免疫治疗提供依据。

1　资料与方法

1.1研究对象选择2015年6月至2016年10月我院收治的35例NHL患者作为研究对象，所有患者经病理学检查确诊为NHL，并处于缓解期。其中男19例，女16例；年龄15～59(30.45±12.57)岁；Ann Arbor分期：Ⅰa期8例，Ⅱa期12例，Ⅱb期7例，Ⅲa期4例，Ⅲb期2例，Ⅳa期2例。对照组为同期体检健康志愿者，男20例，女15例；年龄18～60(35.5±11.5)岁。

1.2仪器与试剂FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)；JSM6510扫描电子显微镜(日本电子株式会社)；JXP15型光学显微镜(上海光学仪器厂)；Bio-Rad Model 680酶标仪(美国Bio-Rad公司)。脾多肽注射液(吉林丰生制药有限公司，商品名：澳莲，批号：15021021)；干扰素-α(interferon-α，IFN-α)、TNF-α、IL-6的酶联免疫吸附试验试剂盒均购自上海沪鼎生物科技有限公司；胎牛血清、RPMI-1640培养基、PBS购自上海哈灵生物科技有限公司；荧光标志的单克隆抗体CD4-FITC、CD123-FE、CD11c- FITC、CD86-APC、BDCA-2-APC、CD80-PeCy5及同型对照IgG1FITC/IgG1-PC5购自美国BD公司。

1.3方法收集NHL患者和对照组患者外周血各2 mL, 放入EDTA-K2抗凝管中，离心(2 000 r·min-1，20 min)，收集单个核细胞，保存在-196 ℃液氮中待测。

1.3.1pDC分选和脾多肽刺激将冷冻的单个核细胞解冻，依次加入适量的CD4-FITC、BDCA-2-APC、CD123-FE单抗，混合均匀后，应用FACSCalibur型流式细胞仪分选，分选后的pDC存活率为96.5%，纯度为96.1%。使用PBS调整分选后pDC密度至1×104·mL-1，然后接种在洁净的24孔平底培养板上，将配制好浓度为0、50、100、200 mg·L-1的脾多肽注射液分别加入到每组中，应用含体积分数5% CO2孵箱37 ℃条件下孵育24 h，将每孔中的上清液收集起来，-20 ℃保存，待测。

1.3.2pDC形态观察应用不同浓度脾多肽注射液刺激5 d后，将收集的上清液每个浓度组各取少部分染色，光镜下观察形态，然后在扫描电镜下观察。

1.3.3外周血pDC检测取一支分选出的pDC，用含有体积分数10%胎牛血清的RPMI-1640培养基稀释至1×106·L-1，接种在48孔培养板(500 μL/孔)中，每孔中加入6 μmol·L-1的PBS，体积分数5% CO2饱和湿度孵箱中37 ℃条件下孵育24 h，收集上清液。采用酶联免疫吸附试验测定各组IFN-α、TNF-α、IL-6水平。

1.3.4pDC的表型检测采用流式细胞术检测pDC的表型，操作如下：1)不同浓度脾多肽注射液刺激5 d后的pDC，每种浓度各1管；2)用PBS冲洗2遍；3)在4 ℃条件下用体积分数10%胎牛血清封闭细胞表面抗体15 min；4)加PBS调密度至1×103·mL-1；5)取细胞悬液100 μL，加入CD11c-FITC、CD86-APC、BDCA-2-APC、CD80-PeCy5单抗各20 μL；6)4 ℃培育30 min；7)上机检测。

2　结果

2.1不同浓度脾多肽处理后pDC形态变化分析不同浓度的脾多肽处理5 d后，光镜下观察，发现pDC的表面突起逐渐明显，随着脾多肽浓度的增加，突起明显变长呈成熟特征，表明脾多肽可以促进pDC的成熟并向DC分化。见图1、2。

图1　不同浓度脾多肽处理5 d后pDC形态变化(HE，×1 000)

图2　不同浓度脾多肽处理5 d后pDC形态的电镜图片

2.2不同浓度脾多肽处理后pDC上清液IFN-α、TNF-α、IL-6表达各浓度脾多肽组pDC上清液中IFN-α、TNF-α、IL-6水平均较脾多肽0 mg·L-1组有明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)，且随着脾多肽浓度的增加而上升明显，各浓度脾多肽组之间差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1　不同浓度脾多肽处理后pDC上清液IFN-α、TNF-α、IL-6表达　ng·L-1

注：各组两两比较，P<0.05

2.3不同浓度脾多肽处理后pDC的表型各浓度脾多肽组pDC细胞的CD11c、CD80、CD86表达阳性率均较脾多肽0 mg·L-1组有明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)，且随着脾多肽浓度的增加而上升明显，各浓度脾多肽组之间差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2　不同浓度脾多肽处理后pDC的表型变化

注：各组两两比较，P<0.05

3　讨论

NHL是常见的淋巴系统恶性肿瘤，其发病率呈逐年增高趋势[2,7]。该病临床特征变化多样，病因、病理和治疗都存在较大差异，迄今临床治愈率仍非常低，一直是位于我国肿瘤发病率和致死率排行榜前10位的疾病，已成为医学上一大难题[8]。既往的研究[9-10]发现NHL的发病与病毒感染、化学物质及放射性物质等密切相关。最近的研究[11-12]发现，免疫功能缺陷是NHL发病的高危因素之一，免疫调节异常可能在NHL疾病的发生、发展中起重要作用。DC是目前已知最强的抗原呈递细胞，在免疫应答、调控上起核心作用，随着对DC研究的不断深入，一些pDC体外诱导、培养实验和动物实验模型相继建立，以DC为基础的主动免疫治疗在肿瘤治疗中受到人们重视，也成了目前研究的热点。

有报道称DC肿瘤疫苗已开始进行Ⅱ期临床试验，并且取得了可喜的效果[13]。Blank等[14]研究发现，在IFN-α、IFN-β、TNF-α等刺激下，DC会上调PD-L1的表达，增强T细胞免疫应答能力。DC主要有2个亚型，mDC和pDC，其中pDC是启动免疫应答的关键，pDC不仅激活初始型T细胞产生免疫应答，而且能启动T细胞介导的免疫应答，在机体免疫中起重要作用。pDC在细菌、病毒的刺激下产生一定数量的TNF-α、IL-6,然后在IL-3刺激下逐渐成熟，向DC分化。IFN-α可以分泌抑制病毒复制的细胞因子，增加巨噬细胞的细胞毒活性，从而增强T细胞的生存和NK细胞活性[7,9,15]。而TNF-α不仅可以促进DC的成熟，同时还可诱导pDC向成熟的DC分化。IL-6联合IFN-α可以促进B细胞向浆细胞分化，这种浆细胞可以分泌抗体从而增加免疫球蛋白的分泌，增强机体的抗感染能力[1,16]。本研究结果显示，各浓度脾多肽组pDC上清液中IFN-α、TNF-α、IL-6水平均较脾多肽0 mg·L-1组有明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)，且随着脾多肽浓度的增加而上升明显，各浓度脾多肽组之间差异有统计学意义(P<0.05)，表明脾多肽可以促进pDC向DC分化，提高其分泌IFN-α，TNF-α、IL-6的量。光镜和电镜下观察，经不同浓度的脾多肽处理后，pDC的表面突起逐渐明显，随着脾多肽浓度的增加，突起明显变长呈成熟特征。pDC的表型检测结果显示，脾多肽能显著提高pDC细胞CD11c、CD80、CD86表达的阳性率，进一步说明脾多肽可促进pDC成熟、分化，同时可以看出，pDC具有提高同种异基因型淋巴细胞增殖的能力，由于pDC不具有TLR4受体，所以同数量下对同种异基因型淋巴细胞增殖的能力低于mDC。提示脾多肽可以促进pDC成熟及向DC分化，进而达到增强机体免疫，提高抵抗力的目的。

脾多肽是由多肽、游离氨基酸、核酸和总糖组成的一种激活及增强机体免疫功能的药物，具有调节免疫、增强机体抵抗力、抗肿瘤及提高骨髓造血功能等作用。可用于化疗引起的白血病、淋巴瘤、白细胞减少及再生障碍性贫血的辅助治疗。脾多肽对机体免疫的双向调节作用，可能就是应为其可以促进pDC成熟及向DC分化，进而达到增强机体免疫，提高抵抗力的目的。

综上所述，脾多肽可能通过促进pDC成熟、分化，上调PD-L1的表达，增强T细胞免疫应答能力，增强机体抵抗力，从而发挥治疗作用。