微小核糖核酸-146a调节CXC型趋化因子4对甲状腺癌细胞侵袭能力的影响

刘艳霞，秦贵军，朱贝贝

(郑州大学第一附属医院内分泌科，河南 郑州 450052)

甲状腺癌是最常见内分泌系统恶性肿瘤，发病原因并不明确，也是人类死亡率较高的恶性肿瘤之一。由于缺乏对甲状腺癌早期症状特异和敏感的监测指标，且大多数患者没有明确的临床症状，发现时已被诊断为甲状腺癌晚期，其生存时间通常很短[1-2]。甲状腺癌的治疗方案通常为手术并辅助内分泌药物和放、化疗联合治疗。尽管近年来甲状腺癌患者的生存有所改善，但大多数甲状腺癌患者预后仍然很差[3]。因此，找到合适的甲状腺癌生物标志物检测指标可能是改善患者治疗效果的关键。

微小核糖核酸(micro ribonucleic acid，miR)是一类长度为17～25个核苷酸的内源性非编码RNA，可通过抑制靶mRNA在生物活动中发挥作用[4]。MiR-146a是一种与肿瘤相关的miR，在多种肿瘤细胞中低表达，与肿瘤细胞的侵袭、增殖和凋亡等均相关，但其具体的分子机制还需要进一步的探索[5-6]。通过生物信息预测网站查找发现miR-146a可靶向CXC型趋化因子受体4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)的3’-非翻译区。CXCX4是一种趋化因子，也是G蛋白偶联受体，在甲状腺癌及其他多种恶性肿瘤中高表达，并通过进一步激活其下游的信号通路来影响恶性肿瘤的炎症、侵袭、凋亡等[7-9]。目前，miR-146a是否可以通过调控CXCR4的表达影响甲状腺癌细胞的侵袭能力还有待研究。本研究以甲状腺癌SW579细胞作为研究对象，探讨miR-146a是否可以通过抑制CXCR4的表达影响SW579细胞侵袭能力，为深入研究甲状腺癌的发病机制提供有力的实验数据。

1　材料与方法

1.1细胞株和试剂人类甲状腺癌细胞株SW579(中国科学院干细胞库)；RPMI-1640培养基(北京索莱宝公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；脂质体Lipofectamine2000(美国Invitrogen公司)；qPCR逆转录试剂盒和SYBR Green荧光染料试剂盒(日本Toyobo公司)，兔抗人CXCR4单克隆抗体和兔抗人β-acitn单克隆抗体(美国Abcam公司)；Transwell基质胶(美国BD公司)；阴性对照、miR-146a mimics均由上海吉玛生物公司合成。

1.2细胞培养SW579细胞培养于RPMI-1640完全培养基中(含有体积分数10%胎牛血清、100 u·mL-1青霉素、100 g·mL-1链霉素)，并置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养，等到细胞融合度达到80%左右时进行传代，或用于后续实验。

1.3细胞转染实验将处于对数期生长的SW579细胞接种到六孔板中，每孔1.5×105个细胞。当细胞融合度达到80%左右时进行转染实验。严格按照Lipofectamine2000试剂说明书进行转染实验，根据目的基因分为：空白对照组、阴性对照组、miR-34a mimics组。

1.4实时定量PCR按照Trizol法处理转染24 h后各组细胞，提取总RNA，并严格按照qPCR逆转录试剂盒进行逆转录和SYBR Green荧光染料试剂盒进行扩增。引物序列为(5'～3')：miR-146a-F： CAGTGCGTGTCGTGGAGT，miR-146a-R：GGTGAGAACTGAATTCCA；CXCR4-F：ACTACACCGAGGAAATGGGCT，CXCR4-R： CCCACAATGCCAGTTAAGAAGA。miR-146a的内参采用U6，CXCR4的内参选用β-actin，实验结果以2-△△Ct法计算miR-146a和CXCR4的相对表达量。

1.5Westernblot严格按照RIPA蛋白裂解液说明书提取各组总蛋白，并用BCA定量法测定各组蛋白的浓度。每孔取25 μg总蛋白进行电泳；用半干转法将蛋白转移到PVDF膜上；用质量分数5%牛血清白蛋白封闭1 h，然后分别加入CXCR4(1500)和β-actin(11 000)单克隆抗体，放入冰箱4 ℃孵育过夜；弃去一抗，加入二抗(11 000)孵育2 h。用超灵敏度化学发光液显色，条带以灰度值表示，采用Image J软件对各组条带进行分析。CXCR4蛋白的相对表达量以CXCR4与β-actin的灰度值比值表示。

1.6Transwell实验先对Transwell小室和24孔板进行平衡：分别在上室加100 μL无血清培养基，下室加750 μL完全培养基，置于37 ℃、体积分数5% CO2环境下过夜。接着将饥饿处理的SW579细胞按照每孔2×104个细胞接种到上室，继续放在37 ℃、体积分数5% CO2的环境下培养36 h。然后擦除上室细胞，用甲醇将小室膜下室侧的细胞固定，苏木素染色后进行拍照，高倍镜下取5个视野进行计数，取其平均值作为侵袭细胞数。

2　结果

2.1SW579细胞miR-146amimics的转染效率实时定量PCR结果显示，miR-146a mimics组(4.12±0.25)的miR-146a相对表达量明显高于阴性对照组(1.06±0.17)，差异有统计学意义(P<0.05)。提示可进行下一步实验。

2.2MiR-146amimics对SW579细胞CXCR4mRNA和蛋白的影响与空白对照组(1.00、1.93±0.07)和阴性对照组(0.92±0.05、1.85±0.06)比较，miR-146a mimics组(0.39±0.11、1.03±0.03)CXCR4 mRNA和蛋白的表达水平均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。空白对照组与阴性对照组CXCR4 mRNA和蛋白的表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、图1。

表1　MiR-146a mimics对SW579细胞CXCR4 mRNA和蛋白表达的影响

注：与空白对照组和阴性对照组比较，1)P<0.05

图1　MiR-146a mimics对SW579细胞CXCR4蛋白表达的影响

2.3MiR-146amimics对SW579细胞侵袭能力的影响Transwell实验结果显示，miR-146a mimics组(25.36±4.65)与空白对照组(60.95±2.41)和阴性对照组(53.83±3.92)比较，SW579细胞的侵袭能力降低，差异有统计学意义(P<0.05)。阴性对照组与空白对照组侵袭能力比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、图2。

表2　MiR-146a mimics对SW579细胞侵袭能力的影响

注：与空白对照组和阴性对照组比较，1)P<0.05

图2　MiR-146a mimics对SW579细胞侵袭能力的影响

3　讨论

甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤之一，随着人类寿命的延长和环境污染的加重，甲状腺癌的发病率呈现出逐年上升的趋势。甲状腺癌在临床上首选手术切除治疗，然后再辅助内分泌药物和放、化疗等治疗方法。由于甲状腺癌发现时大多数已处于晚期，术后仍有很高的复发率，且预后也很差，对患者的生活有很大影响。因此，现在临床急需找到能早期诊断甲状腺癌的检测方法和有较好疗效的治疗手段。

研究[10-12]表明，miR的异常表达与人类的许多疾病密切相关，包括恶性肿瘤、心血管疾病和炎症等。目前很多研究发现miR-146a在甲状腺癌中有显著的差异性表达，即miR-146a呈低表达。MiR-146a是肿瘤抑制基因，位于人类5q33号染色体上，在乳腺癌、胃癌和肝癌等恶性肿瘤中表达降低，并发挥作用[5,13]。MiR-146a可能是通过调节CXCR4的表达，控制下游的信号通路，影响甲状腺癌细胞的侵袭能力。MiR-146a可以通过抑制其靶基因影响甲状腺癌的多种生物学行为，但miR-146a对甲状腺癌的发病机制的具体影响仍需要进一步探讨。本研究发现，过表达miR-146a可抑制SW579细胞的侵袭能力；而且，本研究通过生物信息预测网站发现CXCR4是miR-146a的作用基因之一，并且Bhaumik等[14]已在乳腺癌中进行了验证。CXCR4是一种重要的蛋白受体，位于人类2q21号染色体上，可表达在多种细胞上进而发挥作用。目前，CXCR4在肿瘤治疗中的作用越来越受到重视，Wong等[15]研究发现，CXCR4在甲状腺癌、甲状腺瘤和甲状腺肿等疾病中均有表达且其阳性率呈逐渐下降的趋势。但是，miRNA-146a是否通过调节CXCR4的表达来抑制SW579细胞侵袭功能，尚未见文献报道。本研究还发现，miR-146a还可以抑制CXCR4 mRNA和蛋白在SW579细胞中的表达。因此，miR-34a可能通过靶向抑制CXCR4的表达来影响SW579细胞的侵袭能力。

综上所述，本研究从细胞水平阐明了miR-146a和CXCR4可能参与甲状腺癌的发病机制，miR-146a可能通过靶向调节CXCR4的表达抑制甲状腺癌细胞的侵袭能力，影响甲状腺癌细胞的生物学特性，进而促进甲状腺癌的发生、发展，也为临床甲状腺癌的治疗提供了一个可行的研究思路。