肝细胞癌患者血浆SPINK1水平及其与患者预后的关系分析

王伟，王惠芳，翟景明，封冰

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）为原发性肝癌分类中最常见的组织类型，约占70%～85%。因HCC起病隐匿，早期症状不明显，导致大多数患者在就诊时已处于疾病晚期[1，2]。血清甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）为原发性肝癌患者典型的血清肿瘤标志物，但其用于HCC诊断仍有一定的局限性[3]。丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal 1型（serine peptidase inhibitor Kazal type 1,SPINK1）又称分泌性胰蛋白酶抑制剂（PSTI）或肿瘤相关胰蛋白酶抑制剂（TATI），位于第5号染色体上，具有类似表皮生长因子作用，可通过表皮生长因子受体通路而使肿瘤细胞发生侵袭。近年来，有研究显示SPINK1在结直肠癌、前列腺癌、非小细胞肺癌中均有表达[4-6]。有研究显示SPINK1水平高低可反映肝硬化进展为肝癌的风险大小[7]。本文检测了HCC患者血清SPINK1水平，并分析了其与患者预后的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2014年5月～2015年9月我院收治的HCC患者80例（男48例，女32例；年龄43～66岁，平均年龄54.42±5.61岁；肝功能Child-Pugh A级58例，B级22例）；乙型肝炎肝硬化患者40例（男24例，女16例；年龄45～65岁，平均年龄51.44±5.34岁；肝功能Child-Pugh A级29例，B级11例）。分别符合《原发性肝癌规范化诊断指南(2015年版)》[8]和慢性乙型肝炎防治指南的诊断标准；另选正常人30例（18例，女12例；年龄40～55岁，平均年龄50.40±5.65岁）。本研究获得本院医学伦理委员会审核同意，纳入对象签署知情同意书。

1.2 治疗方法 所有HCC患者均接受肝癌根治术，术前未进行TACE或放射治疗。

1.3 血浆SPINK1和AFP水平检测 采用ELISA法检测血浆SPINK1水平（台湾ABNOVA公司），血浆SPINK水平参考范围为0～2 μg/L；采用ELISA法检测血浆AFP（美国NOVATEINBIO公司），参考范围为 0～20 μg/L。

1.4 预后判断 术后随访2年，随访内容包括一般情况、术后生存时间、肝脏功能、AFP、B超及胸部X线片，以ROC曲线下SPINK1的最佳诊断截断点将患者分为血清SPINK1高水平组和SPINK1低水平组，分析SPINK1与预后的关系。预后指标包括总生存时间（OS）、无瘤生存时间（DFS）和复发率。OS指自随机化分组开始，至因任何原因引起死亡的时间；DFS指根治术后体内无肿瘤病灶，直至肿瘤复发的时间；复发：依据实验室化验和影像学检查结果，综合判定。

1.5 统计学方法 应用SPSS 19.0软件处理数据，复发率等计数资料以%表示，采用x2检验，血浆SPINK1和AFP水平等计量资料以（±s）表示，采用t检验；以1-特异度为横坐标，以灵敏度为纵坐标绘制ROC曲线，评价血浆SPINK1和AFP水平诊断HCC的效能，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组人群血浆SPINK1和AFP水平比较 HCC患者SPINK1水平显著高于肝硬化患者或正常人（t=7.62、t=19.63，P＜0.05）；肝硬化患者血浆 SPINK1水平显著高于正常人（t=17.57，P＜0.05）；HCC患者血浆AFP水平显著高于肝硬化患者或正常人（t=38.40、t=34.108，P＜0.05），肝硬化患者AFP水平与正常人比较差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。

表1 三组人群血浆SPINK1和AFP水平（±s）比较

表1 三组人群血浆SPINK1和AFP水平（±s）比较

与正常人比，①P＜0.05；与肝硬化比，②P＜0.05

例数 SPINK1（μg/L） AFP（μg/L）HCC 80 2.4±0.3①② 125.7±14.5①②肝硬化 40 2.0±0.2① 35.4±4.2正常人 30 1.3±0.1 3.6±0.5

2.2 血浆SPINK1和AFP诊断HCC的效能情况经ROC曲线分析，发现术前血浆SPINK1诊断HCC的曲线下面积为0.768，95%置信区间为0.702～0.837，最佳截断点为 1.70 μg/L，即当 SPINK1=1.70 μg/L时，其诊断HCC的灵敏度和特异度分别为77.2%和67.6%；ROC曲线分析显示术前血浆AFP诊断HCC的曲线下面积为0.735，95%置信区间为0.649～0.824，最佳截断点为 124.8 μg/L，其诊断HCC的灵敏度为63.4%，特异度为62.5%（图1）。

图1 血浆SPINK1和AFP诊断HCC的ROC曲线分析

2.3 术前不同血清SPINK1水平的HCC患者生存情况比较 以上述SPINK1最佳诊断截断点1.70μg/L为界，将患者分为SPINK1高水平组（术前SPINK1＞1.7 0μg/L）和SPINK1低水平组（术前SPINK1＜1.70μg/L）。与术前 SPINK1＜1.70μg/L患者比较，术前SPINK1＞1.7 0μg/L患者OS和DFS均明显缩短，差异有统计学意义（P＜0.05，表2）。

表2 术前不同血清SPINK1水平的HCC患者生存情况（±s）比较

表2 术前不同血清SPINK1水平的HCC患者生存情况（±s）比较

与术前 SPINK1＜1.7 μg/L 比，①P＜0.05

血清SPINK1 例数 OS（m） DFS（m）＞1.7 μg/L 4 12.2±1.3① 11.2±1.2①＜1.7μg/L 38 20.5±2.1 15.7±1.9

2.4 两组复发率比较 术前SPINK1＞1.7 0 μg/L患者术后复发率为38.1%（16/42），显著高于术前SPINK1＜1.70 μg/L 患者的 18.4%（7/38，x2=5.18，P＜0.05）。

3 讨论

我国HCC发病率较高，全球每年新发HCC患者中50%以上来自中国，HCC多由肝硬化发展所致，肝硬化可经再生结节、低度不典型增生结节、高度不典型增生结节、增生结节癌变等“多步骤癌变”途径转变为HCC。因此，早期对肝硬化患者进行定期检查，寻找有效的指标准确诊断HCC并采取合理治疗措施有重要现实意义[9]。现阶段血清肿瘤标志物的检测因具有特异性高、敏感性高、痛苦少、费用相对较低等优点而成为研究的热点，其中经典生物标志物AFP诊断HCC的灵敏度、特异度不高。肿瘤的发生是一个渐进的过程，其中抑癌基因失活为导致肿瘤细胞增殖、浸润及远处转移的基础，丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpins）为最新发现的肿瘤抑制基因，serpins与丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族具有高度同源性[10，11]。SPINK1 作为 serpins家族一员，最早从牛的胰腺中分离出来，因此被称为PSTI，后在卵巢癌患者尿液中也被发现，因此又称为TATI。SPINK1由位于人体第5号染色体的四个外显子组成的基因编码，SPINK1由56个氨基酸组成，经3个二硫键连接，是激活胰蛋白酶原的第一道防线，主要功能为抑制胰蛋白酶活性，同时这种作用是可逆的。研究显示SPINK1常以高水平出现在胰腺及胰液中，主要作用为可逆性阻止丝氨酸蛋白酶依赖的细胞凋亡。当持续保温时，胰蛋白酶会裂解SPINK1的肽键而导致SPINK1蛋白复合物迅速解离，如此循环，有利于防御胰蛋白酶过早激活[12-14]。Jobst J et al[15]采用逆转录PCR（RT-PCR）检测确定肝细胞癌与非肝细胞癌组织特异性基因表达谱及表达水平，结果显示SPINK1/TATI在肝癌组织呈最稳定的表达，阳性率为90%，因此认为SPINK1/TATI可作为丙型肝炎病毒引起肝癌的肿瘤标志物，有助于早期地诊断肝癌。Marshall A et al[16]的研究结果显示遗传性血色病并发肝癌组织SPINK1 mRNA呈高水平，在肝硬化结节、混合病因肝癌中其阳性率分别为0%或79%，因此认为SPINK1作为分泌型胰蛋白酶抑制剂，是诊断肝癌潜在的标志物，但国内关于SPINK1在HCC患者的临床意义还少有报道。

有人[17]采用RT-PCR、免疫印迹法和ELISA法检测了乙型肝炎病毒（HBV）感染对SPINK1的影响及其调节机制，他们发现SPINK1在慢性乙型肝炎患者血清中水平显著升高，肝硬化和肝细胞癌患者血浆SPINK1水平显著高于慢性乙型肝炎患者。本研究结果显示HCC患者、肝炎肝硬化患者、正常人血浆SPINK1水平依次减少，且三组血浆SPINK1水平两两比较差异均有统计学意义，与上述报道结果基本一致，因而在HCC患者，血浆SPINK1水平升高，同时HCC患者血浆SPINK1水平显著高于肝炎肝硬化患者，体现了SPINK1作为HCC标志物的可能性。国外学者Hass HG et al[18]的研究结果发现在肝癌组织AFP阳性率仅为30%，而64%～82%肝癌组织 OPN、SPINK1、GPC3、HSP90 和 knpa2 阳性，因此认为 OPN、SPINK1、GPC3、knpa2在肝癌组织有较高水平的表达，这些基因有助于未来发现肝癌生物标记物并制定新的诊断肝癌策略。本研究结果显示HCC患者血浆AFP较肝硬化患者和正常人高，肝炎肝硬化患者血清AFP水平高于正常人。ROC曲线分析结果显示血浆SPINK1水平诊断HCC的灵敏度为77.2%，特异度为67.6%，而血浆AFP分别为63.4%和62.5%，与有关研究[19-22]结果相近，表明血浆AFP在肝硬化阶段也有升高，血浆SPINK1水平在肝硬化阶段也已开始上升，当发展至HCC时，其水平更高。因此，SPINK1诊断HCC的效能可能较AFP好，具有更高的灵敏度和特异度，有成为HCC标志物的潜能。在SPINK1与预后关系方面，另有研究结果[23,24]显示，在随访58.6 m期间，SPINK1高水平组中位生存时间为12.3 m，较SPINK1低水平组的29.2 m缩短，SPINK1高水平组术后无瘤生存时间也明显短于SPINK1低水平组，而复发率高于SPINK1低水平组，进一步分析结果显示SPINK1高水平是肝癌术后总体生存和无瘤生存的独立危险因素，而本研究结果显示SPINK1高水平组总生存时间和无瘤生存时间均较SPINK1低水平组短，前者术后2年内复发率高于后者，与上述研究结果相近，因此HCC患者血浆SPINK1水平高低与其预后关系密切，术前检测血浆SPINK1水平对于预测预后有重要的参考价值。

综上所述，HCC患者血浆SPINK1水平显著高于肝硬化患者，与AFP相比，有类似的诊断HCC效能。但如何提高其诊断的灵敏性、特异性和正确率，将是未来研究的热点。