高盐饮食对去甲肾上腺素诱导的Dahl盐敏感大鼠肠系膜动脉收缩反应的影响

李师承　陈连凤　冯淑怡　武燕翔　王青海　严晓伟

100730 中国医学科学院 北京协和医院心内科(李师承、陈连凤、武燕翔、王青海、严晓伟)；100700 北京，中国中医科学院医学实验中心(冯淑怡)

高血压可引起血管功能与结构的改变[1]，血管舒缩功能的异常可使血管对升压物质的反应性发生改变[2]，如交感神经兴奋、肾素血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)激活等，可能是临床上导致高血压患者血压波动或控制不良的常见原因。此外，人体内高血压及高盐饮食可促进儿茶酚胺分泌，进一步引起血压和血管功能的变化[3]。

以往有关高血压血管功能的研究，由于受技术、条件的限制，大多在体外使用动脉环或一段血管进行实验[4-5]，并不能反映在体状态下的神经、体液、内分泌等调节机制的真实情况，且无法观察血管中血流的变化；部分在体研究[6]，仅通过观察主动脉血流动力学的改变，研究血管对儿茶酚胺的反应，但大血管和小血管或微血管在血压形成和维持中的作用存在较大差异。本研究选用Dahl盐敏感大鼠，使用不同含盐量的饮食干预后，在体观察其肠系膜小动脉(mesenteric small artery，MSA)管径和血流灌注对去甲肾上腺素(noradrenaline，NA)反应的变化，进一步探索高盐摄入对盐敏感个体外周阻力动脉功能的影响，明确高盐摄入引起血压升高的机制。

1　材料与方法

1.1　实验材料

实验动物：8周龄健康雄性Dahl盐敏感(Dahl/SS)大鼠32只，清洁级，体重(220±10)g，购于北京维通利华实验动物中心；设备：小动物无创血压计(北京软隆生物技术有限公司BP-2010A)，BX51W1显微镜(日本奥林巴斯公司)，GigaView高速摄像机(美国Southern Vision Systems公司)，全视野激光散斑灌注血流仪(full-field laser perfusion imaging，LPI，英国Moor Instruments公司)；药物与试剂：盐酸贝那普利片(北京诺华制药有限公司)，戊巴比妥钠(美国Sigma-Aldrich公司)，重酒石酸去甲肾上腺素注射液(天津金耀药业)；大鼠饲料：在普通大鼠饲料的基础上调整含氯化钠(NaCl)量，分为高盐8%NaCl大鼠饲料、低盐0.3%NaCl大鼠饲料、普通正常大鼠饲料(0.6%NaCl)，购于北京科澳协力饲料有限公司。

1.2　实验分组

经1周适应性喂养后，32只Dahl/SS大鼠按区组随机化分为4组：高盐8%NaCl饮食[7](HS组)、低盐0.3%NaCl饮食[7](LS组)、高盐饮食贝那普利10 mg·kg-1·d-1[8]灌胃(HB组)、正常0.6%NaCl饮食对照组(NS组)，每组8只。所有Dahl/SS大鼠均使用相应分组的不同含NaCl量饲料饲养，进行6周饮食干预。大鼠全程饲养于北京协和医院动物实验中心SPF级动物房，室温25℃，湿度45%，每日明暗交替各12 h，定期更换垫料保持干燥，自由饮水和进食。本实验伦理方案由北京协和医院伦理委员会通过(许可编号：XHDW-2017-011)，实验全程严格遵守伦理要求和实验动物指南要求。

1.3　体重和血压测量

在饮食干预前及干预6周末测量Dahl/SS大鼠体重和血压。采用间接测压法测定大鼠尾动脉血压，测量时使用恒温(37℃)鼠笼固定，保持大鼠在安静状态下重复测量3次，每次间隔5 min，取均值为最终血压值，同时记录3次心率，取平均值。

1.4　血液和尿液分析

血浆分析：内眦取血法取1 ml血液置于血清采血管，静置30 min后离心(2 000 r/min，20 min)，用于肌酐、尿素、血钾测定。尿液分析：使用代谢笼收集大鼠24 h尿液，同时记录总尿量，用以测定24 h尿钠、尿蛋白水平。尿液和血清分析采用生化法检测，由北京协和医院检验科协助完成。

1.5　NA诱导肠系膜血管血流灌注改变的测定

饮食干预6周后，腹腔注射戊巴比妥钠(25 mg/kg)麻醉Dahl/SS大鼠，打开腹腔，找到回肠末端肠系膜，约2 cm。该段肠系膜平铺于大鼠腹内(生理盐水湿润的小方纱垫在肠系膜下方)，使用LPI连续记录该段肠系膜血管的血流灌注情况，待灌注值稳定记录5 min后，经大鼠股静脉注射NA 10 μg/kg后继续连续记录血流灌注情况15 min。通过配套软件分析，选取3段不同的肠系膜二级血管，取平均值，计算药物注射前后平均血流灌注下降率及最大血流灌注下降率。

肠系膜血管平均血流灌注下降率定义：[(药物注射前10 s的血流平均灌注值-药物注射后第10至20 秒血流平均灌注值)/药物注射前10 s的血流平均灌注值]×100%；肠系膜血管最大血流灌注下降率定义：[(药物注射前10 s的平均血流灌注值-药物注射后血流灌注最小值)/药物注射前10 s的平均血流灌注值]×100%。

1.6　NA诱导MSA收缩反应的测定

麻醉后打开腹腔的大鼠取侧卧位，轻轻游离出一段接近回盲部的肠系膜轻缓平铺于恒温观察槽，维持槽温度37℃，每10 min更换Krebs-Henseleit液(mmol/L：NaCl 118，NaHCO325，KCl 4.7，CaCl22.5，MgSO4·7H2O 1.2，KH2PO41.2，Glucose 10，pH=7.4)。在显微镜物镜40倍下找到MSA并观察，使用配套的高速摄像机同步捕获分析血管的变化，实时测量动脉管径。待第1次注射NA 30 min排除药效影响后[9]，连续记录Dahl/SS大鼠MSA 3 min，从大鼠股静脉注射NA 10 μg/kg，继续使用显微镜和高速摄像机连续记录血管变化，直至管径恢复至用药前。通过高速摄像机配套的软件分析，可以获得MSA内径最大下降率、收缩时间、收缩最明显时的时间、收缩持续时间。MSA内径最大下降率=[药物注射前动脉内径-药物注射后最小动脉内径)/药物注射前动脉内径]×100%；收缩时间指从注射NA到MSA开始收缩的时间；收缩最明显时的时间指从注射NA到MSA收缩率达到最大的时间；收缩持续时间指MSA由开始收缩到明显舒张所用的时间。

预实验中，经使用NA 2.5、5、10、15和20 μg/kg进行浓度效应关系测试后，确定NA 10 μg/kg在最佳浓度范围内，故使用该剂量进行实验。

1.7　统计学方法

2　结果

HS组中1只大鼠在注射NA，并完成部分测定指标后猝死，HB组中2只大鼠在麻醉过程中死亡。最终NS、LS、HS和HB组分别有8、8、7和6只大鼠纳入统计。

2.1　血压、心率和体重

各组Dahl/SS大鼠基线(0 w)血压无差异，经6周饮食干预后，NS、HS和HB组的收缩压较基线明显升高(均为P<0.01)，LS组则比基线降低(P=0.02)；HS和HB组6周末舒张压较基线明显升高，LS组舒张压较基线降低(均为P<0.01，图1 A和B)。

经6周饮食干预后，LS组收缩压[(118.7±6.0)mmHg 比(131.2±3.4)mmHg，P<0.01]和舒张压[(95.8±6.5)mmHg 比 (107.3±6.0)mmHg，P=0.02]显著低于NS组；与NS组比较，HS组[收缩压：(161.4±9.7)mmHg 比 (131.2±3.4)mmHg；舒张压：(135.7±5.5)mmHg 比 (107.3±6.0)mmHg，均为P<0.01]和HB组[收缩压：(137.8±5.7)mmHg 比 (131.2±3.4)mmHg；舒张压：(117.0±4.8)mmHg 比 (107.3±6.0)mmHg，均为P<0.05]收缩压和舒张压均显著升高；HB组(均为P<0.05收缩压和舒张压均低于HS组(P<0.01，图1 C)。

各组大鼠的基线心率无差异；6周末，LS组心率低于NS组(P=0.03)、HS组(P<0.01)和HB组(P<0.01)，NS、HS和HB组无差异(图1 D)。饮食干预前基线和干预6周后各组大鼠体重比较无差异(均为P>0.05)。

2.2　血液和尿液分析结果

经6周饮食干预后，HS组(P<0.01)、HB组(P<0.01)和LS组(P=0.02)血清肌酐水平均高于NS组；LS组血清尿素水平低于NS组(P<0.01)，HB组血清尿素水平高于HS组(P<0.01)。

6周末24 h尿液分析显示，高盐摄入的HS和HB组24 h尿钠排泄明显高于NS和LS组(均为P<0.05)；LS组24 h尿蛋白定量低于NS组(P=0.03)；HS组和HB组24 h尿蛋白定量显著高于NS组(均为P<0.01)，见表1。

A：基线与6周末SBP；B：基线与6周末DBP；C：6周末血压；D：基线与6周末心率；SBP：收缩压；DBP：舒张压；与NS组比较，aP<0.05；与LS组比较，bP<0.05；与HS组比较，cP<0.05图1　大鼠基线与饮食干预后血压和心率变化

2.3　NA诱导肠系膜血管血流灌注变化的结果

6周饮食干预后，使用LPI记录Dahl/SS大鼠MSA血流灌注情况(图2 A、B)。注射NA后，HS组平均血流灌注下降率明显高于NS组(33.50%±5.14%比21.60%±6.16%，P<0.01)和LS组(P<0.01)，LS组平均血流灌注下降率低于NS组(14.94%±2.90%比21.60%±6.16%，P=0.02)，见图2C。对比最大血流灌注量下降率，HS组明显高于LS组(45.74%±10.17%比28.78%±6.21%，P=0.04)，余各组间比较无差异，见图2D。

2.4　NA诱导MSA收缩反应的结果

通过显微镜和高速摄像机记录MSA在注射NA前后的变化(图3 A、B)。注射NA后，HS组MSA内径最大下降率明显大于NS组(34.90%±15.46% 比 18.34%±4.15%，P=0.01)和LS组(34.90%±15.46% 比 13.63%±10.33%，P<0.01)，HB与HS组无差异(P=0.46)，见图3A。

注射NA后，大鼠MSA开始收缩的时间、收缩持续时间、达到最大收缩的时间均反映了MSA对NA的反应性和敏感性。各组间比较，LS组MSA收缩持续时间明显短于HS组[(16.4±1.8)s 比 (23.9±8.0)s，P=0.02]，NS、HS和HB组无明显差异(均为P>0.05)，见图3B；各组间MSA开始收缩时间、达到最大收缩的时间均无明显差异(均为P>0.05)。

3　讨论

本研究在体观察到高盐饮食可引起Dahl/SS大鼠MSA对NA反应增强，MSA收缩显著并伴血流灌注明显降低，贝那普利治疗不足以逆转高盐摄入引起的肠系膜动脉对NA的高反应性，而低盐饮食则可降低大鼠MSA对NA的高反应性。

既往对Dahl/SS大鼠血管功能的研究，主要采用离体主动脉或肠系膜动脉，以观察各种因素对血管内皮功能的影响[10]。本研究不同于以往研究的最大特点，是采用最新的实验手段，在体观察盐敏感高血压大鼠模型肠系膜血管对升压物质的反应性，研究结果更直观地反映高盐摄入对阻力血管功能的影响及其在高血压形成和维持中所起的作用，为盐敏感高血压的控盐治疗提供了理论依据。

表1　血液和尿液分析结果

注：Cr：血清肌酐；Urea：血清尿素；K+：血钾；U-Na：24 h尿钠；U-Pro：24 h尿蛋白定量；与NS组比较，aP<0.05；与LS组比较，bP<0.05；与HS组比较，cP<0.05

LPI探测HS组大鼠A：注射NA前MSA的基础血流灌注丰富(血流灌注越多图像颜色越接近红色，反之显示为浅绿色)；B：注射NA后MSA血流灌注较注射前明显下降；C：NA诱导的MSA血流灌注量下降率；D：NA诱导的MSA血流灌注量最大下降率；与NS组比较，aP<0.05；与LS组比较，bP<0.05图2　Dahl/SS大鼠MSA血流灌注结果

A：NA诱导的MSA内径最大下降率；B：NA诱导的MSA收缩持续时间；与NS组比较，aP<0.05；与LS组比较，bP<0.05图3　Dahl/SS大鼠MSA血管收缩结果

在以往离体血管的研究中，使用微血管张力测定仪记录不同干预手段引起血管舒缩功能的变化[11]，只能观察血管的舒缩情况，并不能真实反映在体血管的功能。为了实时观察Dahl/SS大鼠MSA的血流动力学变化，我们采用LPI直接观测MSA管径和血流灌注的改变。LPI可以对组织进行实时的血流动态成像监测，为微循环研究提供了可靠方法[12]。在国外，LPI多用于临床检测局部组织的灌注情况，如肢端缺血[13]、脑组织灌注[14]、皮下血运情况[15]等。本研究使用LPI检测血流灌注结合显微镜下血管内径的改变，实践证明其是在体状态下观察血管舒缩功能和血流灌注有效工具。

在临床上，血压波动是高血压患者的常见主诉，也是引起患者不适的主要原因之一[16]。常表现为患者在晨起、运动、情绪激动、劳累、诊室就诊等情况下血压显著升高，而在平静状态下血压良好，甚至偏低。这种血压波动的现象给药物治疗的调整带来很大困难。本研究发现，在高盐摄入的情况下，这种阻力动脉对升压物质的高反应性，可能是导致血压波动的原因之一；而低盐饮食可以在一定程度上降低血管对NA的反应性。同样，在盐敏感的高血压患者，高盐引起血管对升压物质反应增加，可能是导致血压升高、血压波动和靶器官损伤的原因之一。但临床医生所面临的困难是目前尚缺乏简便有效的、诊断盐敏感高血压的方法。结合本研究发现，在临床工作中，对那些应用多种药物血压控制不良或血压波动明显的患者，应通过测定24 h尿钠排泄量估算患者的摄盐量，尤其在那些老年、肥胖、胰岛素抵抗以及有明确高血压家族史的盐敏感高发人群。对高盐摄入的患者，积极地限制钠盐摄入对于解除阻力血压的高反应性，保持血压的平稳下降，减少靶器官损害可能具有十分重要的意义。

高盐摄入可致肾功能损害[7]。贝那普利是血管紧张素转换酶抑制剂类药物，通过抑制RAS及降低交感兴奋等作用降低血压，此外，其扩张肾小球入球和出球小动脉、降低基底膜通透性从而减轻肾损害。在本研究中HS和HB组大鼠尿蛋白和血肌酐无差异地(尿蛋白：P=0.06，血肌酐：P=0.47)比NS组升高，这两组血管对NA的反应性无差异。既往研究发现，RAS抑制剂对高盐摄入引起的高血压疗效不佳[17-18]，结合本研究发现，可能与RAS抑制剂不能改善血管的收缩反应性有关。

本研究局限性包括：(1)各组动物数量较少(6～8只大鼠)。由于Dahl/SS大鼠为近交系，个体性状趋于稳定一致，类似动物实验多采用上述样本量。此外，主要研究参数在HS、NS和LS组间差异非常显著，保证了研究结论的可靠性；(2)Dahl/SS大鼠与高血压患者存在本质区别，动物实验结果并不完全适用于人类。但Dahl/SS大鼠是业界公认的进行高血压病理生理研究的动物模型，研究发现对了解人类盐敏感高血压的形成和发展具有重要参考价值；(3)由于时间仓促，本研究仅介绍了高盐饮食对大鼠血管功能影响的实验发现，并未进行相关机制的探讨，进一步针对组织RAS和儿茶酚胺受体的机制研究正在进行之中，后期将陆续发表。

综上所述，高盐摄入加重了肠系膜动脉对NA的收缩反应，同时也降低了肠系膜血管的血流灌注水平，RAS抑制剂贝那普利不足以逆转高盐摄入所致的肠系膜动脉损害。高盐饮食在盐敏感高血压患者可能是引起血压波动、控制不良的原因之一。研究结果再次强调了限盐在高血压治疗中的重要意义。

利益冲突：无