Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的检测对甲状腺腺瘤患者及临床意义

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(长海医院内分泌科，上海 200433)

甲状腺腺瘤在人群中有很高的发病比例，随着目前人群健康体检的重视，使得甲状腺腺瘤的检出率逐年提高。据统计结果表明，甲状腺腺瘤在全球以每年4%发病率的趋势增长[1]。目前甲状腺腺瘤的发病机制及诊断是研究的热点。近年来，经典Wnt/β-catenin信号通路对癌干细胞的影响成为热点[2-4]。较多研究表明[5-7]，Wnt/β-catenin信号通路参与调节结直肠癌、前列腺癌、乳腺癌肿瘤等疾病的发生、发展。但有关Wnt/β-catenin信号通路在甲状腺腺瘤发病机制中的研究较少。因此，本研究拟探讨甲状腺腺瘤患者Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白Wnt-1，β-catenin的检测及临床意义。

1　资料与方法

1.1一般资料收集我院2016年1月～2017年1月60例甲状腺腺瘤患者，纳入标准：①经术前CT核素扫描、颈部超声及穿刺组织后病理检查证实为单发甲状腺腺瘤；②所有患者均未经任何药物治疗。排除标准：①临床资料不完整者，伴有其他恶性疾病者；②未获得患者知情同意者。同时选取我院同期60例健康体检者作为对照组，且该60例健康体检者自愿接受免费组织穿刺病理检查并签署知情同意书。疾病组60例，男31例，女29例，年龄21～87岁，平均57.7±2.8岁。对照组60例，男30例，女30例，年龄20～85岁，平均57.9±3.0岁。两组的一般资料有可比性。本研究通过我院伦理委员会审核。

1.2主要仪器和试剂TGL-16G-A型高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；7300型实时荧光定量PC电子天平R仪(美国Applied Biosystems公司)；EL204- (上海特勒-托多利多仪器有限公司)。

1.3RT-PCR检测Wnt-1、β-catenin mRNA表达水平提取组织总RNA，测定RNA纯度和浓度，取1μg进行逆转录，生成cDNA。采用SYBR green染料法进行定量检测，Wnt-1、β-catenin及GAPDH(内参)扩增引物序列如下：Wnt-1：上游引物5′-CTGCAGAGCATGGACTCGTC-3′，下游引物5′-CCGTTGAAGAGAGTGGAGTG-3′，β-catenin：上游引物5′-TACTCACGC CTCGAAACCT-3′，下游引物5′-GTC TGCTTTCCTCCCTGATG-3′，GAPDH：上游引物5′-CCTAGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3，下游引物5′-GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3，扩增条件及计算方法参考文献[8]。

1.4Western blot检测Wnt-1、β-catenin蛋白的表达水平常规方法提取组织总蛋白，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)方法测定蛋白质含量后，进行凝胶电泳，每孔上样20 μg，电转至聚偏氟乙烯薄膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上后，3%的脱脂奶封闭2 h，分别孵育Wnt-1、β-catenin(目的蛋白)和内参蛋白一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，孵育二抗后显影[9-10]。

1.5统计学分析采取SPSS 17.0软件。对于正态分布和偏态分布数据资料，分别以均值±标准差和中位数(P25-P75)表示。正态分布数据两组间比较采用两独立样本t检验，偏态分布两组间比较则应用Mann-Whitney U法。率的比较采用卡方检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1RT-PCR检测Wnt-1、β-catenin mRNA表达水平结果采用RT-PCR方法检测两组研究对象组织中Wnt-1、β-catenin mRNA表达水平，甲状腺腺瘤组Wnt-1、β-catenin mRNA表达量高于对照组Wnt-1、β-catenin mRNA表达量，差异有统计学意义(P<0.05)，具体见表1。

表1　RT-PCR检测Wnt-1、β-catenin mRNA表达水平结果　(n=60)

与对照组相比，aP<0.05

2.2Western blot检测Wnt-1、β-catenin蛋白表达水平结果采用Western blot方法检测两组研究对象组织中Wnt-1、β-catenin 蛋白表达水平，甲状腺腺瘤组Wnt-1、β-catenin 蛋白表达量高于对照组Wnt-1、β-catenin 蛋白表达量，差异有统计学意义(P<0.05)，具体见表2和图1。

表2　Western blot检测Wnt-1、β-catenin蛋白表达水平结果　(n=60)

与对照组相比，aP<0.05

图1　Wnt-1、β-catenin蛋白的表达

2.3Wnt-1、β-catenin表达与甲状腺腺瘤患者临床病理学特征关系分析

甲状腺腺瘤患者肿瘤组织Wnt-1阳性率65.00%(39/60)高于对照组Wnt-1阳性率21.67%(13/60)，差异有统计学意义(P<0.05)。甲状腺腺瘤患者肿瘤组织β-catenin阳性率61.67%(37/60)高于对照组β-catenin阳性率20.00%(12/60)，差异有统计学意义(P<0.05)。统计分析证实Wnt-1表达与甲状腺腺瘤患者肿瘤直径密切相关，差异有统计学意义(P<0.05)。β-catenin表达也与甲状腺腺瘤患者肿瘤直径密切相关，差异有统计学意义(P<0.05)。具体见表3。

表3　甲状腺腺瘤患者Wnt-1、β-catenin表达与患者临床病理学特征关系分析　(例,%)

与肿瘤直径(cm)≤4比较，aP<0.05

3　讨　　论

甲状腺腺瘤是起源于甲状腺滤泡细胞的良性肿瘤，目前认为本病多为单克隆性，是由与甲状腺癌相似的刺激所致，好发于甲状腺功能的活动期。甲状腺腺瘤有癌变的可能，并可引起甲状腺功能亢进症，对患者的生活质量和生命健康影响较大，因此研究甲状腺腺瘤的发病机制，对于甲状腺腺瘤的临床诊断、以及对于甲状腺腺瘤新治疗药物的研究均具有非常重要的意义。

Wnt/β-catenin信号通路中的β-catenin蛋白是一种多功能的细胞浆蛋白质，在疾病状态下，由于体内环境的变化，游离的β-catenin蛋白进入细胞核，参与调节相关基因的表达[11-13]。本研究结果提示，甲状腺腺瘤患者Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白Wnt-1，β-catenin蛋白表达上调，甲状腺腺瘤组肿瘤组织Wnt-1，β-catenin表达阳性率高于对照组Wnt-1，β-catenin表达阳性率，Wnt-1表达与甲状腺腺瘤患者肿瘤直径密切相关，β-catenin表达也与甲状腺腺瘤患者肿瘤直径密切相关，结果提示，Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白Wnt-1，β-catenin蛋白表达水平与甲状腺腺瘤疾病的生物学状态密切相关，Wnt/β-catenin信号通路的激活可能在甲状腺腺瘤的发生、发展过程中起重要作用。

综述所述，甲状腺腺瘤患者Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白Wnt-1，β-catenin蛋白表达上调，且其表达与甲状腺腺瘤的肿瘤生物学状态密切相关，为今后通过阻断Wnt/β-catenin信号通路为措施的靶向治疗甲状腺腺瘤提供了实验依据。