流动注射化学发光法在线检测饮用水中脱氧雪腐镰刀菌烯醇

杨盼盼 唐书泽 吴事正 李 梁 滕久委

(1. 暨南大学理工学院食品科学与工程系，广东 广州 510632；2. 暨南大学国际学院，广东 广州 510632)

近年来，突发性水污染事故及人为水中投毒时有发生。中国环境保护部调查显示， 1996～2006年共有558起水污染事故，其中52%是突发性事件[1-3]。建立应对突发性水污染的快速在线检测方法，是饮用水安全预警，科学判断，正确处理，预防重大食品安全突发事故急需研究的课题。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)又名呕吐毒素，属于B族单端孢霉烯族化合物，由禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌等真菌产生，主要来源于受污染的谷物[4-5]。人与动物食用少量受DON污染的食物后，会产生中毒症状，例如体重减少、拒食、恶心、呕吐等，长期摄入可导致免疫功能受损，甚至引发更严重疾病[6-7]。DON溶于水，易在谷物中富集，是饮用水的一种潜在污染毒素[8-9]。

检测DON的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[10-11]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[12]、酶联免疫法(ELISA)[13]、高光谱图像[14]、化学发光磁酶免疫法[15]等。这些方法存在仪器价格昂贵、耗时、重复性差等缺点。流动注射化学发光法具有检测限低，灵敏度高，检测速度快、线性范围宽等优点[16-17]。本课题组前期研究开发了针对秋水仙碱[18]、3-硝基丙酸[19]、黄绿青霉素[20]等毒素的流动注射化学发光快速检测方法。本研究拟基于DON对鲁米诺-过氧化氢化学发光体系的增强作用，建立一种用于饮用水中DON突发性污染的快速在线检测方法。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

1.1.1 主要仪器设备

蠕动泵：BT100-1F型，保定兰格恒流泵有限公司；

微弱发光测量仪：BPCL-K型，北京亚泊斯科技有限公司；

六通阀：C22Z型，美国VICI公司；

紫外、可见、近红外分光光度计：UV-3600Plus型，日本岛津有限公司。

1.1.2 主要试剂

鲁米诺、脱氧雪腐镰刀菌烯醇：分析纯，美国Sigma公司。

1.2 试验方法

1.2.1 进样方法 DON流动注射化学发光测定流程图见图1。过氧化氢溶液、鲁米诺溶液、表面活性剂溶液及样品DON溶液在蠕动泵的推动下进入六通阀，通过调节六通阀，使各流路在流通池中均匀混合，并发生化学发光反应，光电倍增管捕捉并扩大发光信号，然后通过信号分析器，将光信号转换成电信号后，输送至计算机，利用计算机内所装的微弱发光测量系统专用软件，对样品进行发光强度测量，从而进行样品DON分析。

A. 过氧化氢溶液 B. 鲁米诺溶液 C. 表面活性剂溶液 D. DON溶液 P. 蠕动泵 V. 六通阀 F. 流通池 PMT. 光电倍增管 NHV. 负高压 W. 废液

图1 流动注射化学发光流程图

Figure 1 Schematic diagram of flow-injection chemiluminescence system

1.2.2 流路及其参数选择

(1) 蠕动泵泵前管路选择：在流速17 mL/min，过氧化氢浓度0.1 mol/L，氢氧化钠浓度0.1 mol/L，鲁米诺浓度1×10-5mol/L，表面活性剂浓度10%，DON浓度 0.2 mg/L的条件下，分别调节泵前长度20，30，40 cm，观察液体能否从烧杯进入到软管中。

(2) 蠕动泵流速选择：在泵前长度30 cm，过氧化氢浓度0.1 mol/L，氢氧化钠浓度0.1 mol/L，鲁米诺浓度1×10-5mol/L，表面活性剂浓度10%，DON浓度0.2 mg/L的条件下，分别调节泵速为5，7，9，11，13，15，17 mL/min，观察化学发光所需的时间及化学发光强度，确定最佳的流速。

1.2.3 表面活性剂选择 在光电倍增管负高压为750 V，过氧化氢浓度0.1 mol/L，氢氧化钠浓度0.1 mol/L，鲁米诺浓度1×10-5mol/L，DON浓度 0.2 mg/L的条件下，表面活性剂分别选择10%吐温80、10%卵磷脂、10%十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate，SDS)、10%十六烷基三甲基溴化铵 (Hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)，考察不同表面活性剂对化学发光强度的影响。

1.2.4 单因素试验 影响化学发光强度的主要因素有氢氧化钠浓度、鲁米诺浓度、过氧化氢浓度、吐温80浓度。单因素试验流程和参数分别见1.2.1、1.2.2，光电倍增管负高压750 V，分别考察各因素对化学发光强度的影响。

(1) 氢氧化钠浓度的选择：在过氧化氢浓度0.1 mol/L，鲁米诺浓度1×10-5mol/L，吐温80浓度10%、DON浓度 0.2 mg/L的条件下，分别考察氢氧化钠在0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 mol/L时的化学发光强度。

(2) 鲁米诺浓度的选择：在过氧化氢浓度0.1 mol/L，氢氧化钠浓度0.02 mol/L，吐温80浓度10%，DON浓度 0.2 mg/L 的条件下，分别考察鲁米诺在2×10-4，4×10-4，6×10-4，8×10-4，1×10-3mol/L时的化学发光强度。

(3) 过氧化氢浓度的选择：在氢氧化钠浓度0.02 mol/L，鲁米诺浓度8×10-4mol/L，吐温80浓度10%，DON浓度0.2 mg/L 的条件下，分别考察过氧化氢浓度0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mol/L时的化学发光强度。

(4) 吐温80浓度的选择：在氢氧化钠浓度0.02 mol/L，过氧化氢浓度0.6 mol/L，鲁米诺浓度8×10-4mol/L，DON浓度0.2 mg/L的条件下，分别考察吐温80浓度为2%，4%，6%，8%，10%时的化学发光强度。

1.2.5 响应面设计 依据单因素试验结果，利用Box-Behnken中心组合设计原理，对试验有影响的4个因素，即氢氧化钠浓度、鲁米诺浓度、过氧化氢浓度和吐温80浓度进行四因素三水平响应面优化试验，用Design Expert 8.0软件对试验数据进行回归分析。

1.2.6 标准曲线绘制、精密度及检出限确定 在优化试验条件下，测定DON浓度在0.001～4.000 mg/L时的化学发光强度。以DON的浓度为横坐标，发光强度为纵坐标绘制标准曲线，并计算精密度和检出限。

1.2.7 回收率测定 在优化试验条件下，分别在自来水和蒸馏水中加入定量的DON，测定回收率，并对自来水中的干扰离子进行分析。

2 结果与讨论

2.1 反应机理探讨

鲁米诺-过氧化氢体系在碱性溶液中的发光机理已有报道[21-23]。在本试验中，为了探讨发光机理，利用紫外、可见、近红外分光光度计在190～400 nm下对4种溶液进行紫外吸收光谱分析，结果见图2。鲁米诺—过氧化氢分别在289，345 nm处有2个峰，分别加入DON和吐温80后，峰的位置基本没有变化，也无其他峰出现，说明加入DON和吐温80后没有生成新的物质，DON和吐温80在这一体系中可能起到催化的作用。反应机制可能为：① 鲁米诺和过氧化氢在碱性的条件下，形成阴离子；② 由于吐温80的存在，改变了化学发光反应的微环境；③ 由于微环境中胶束的存在，3-氨基邻苯二甲酸根被富集，导致激发态中间体的寿命延长和产率增加[24]，从而增强体系的化学发光强度。

2.2 流路及其参数的选择

2.2.1 蠕动泵泵前管路的选择 试验使用的驱流装置为蠕动泵，在试验过程中，蠕动泵前管路过长或者过短，都会由于压力的原因使液体无法进入管中。因此试验得到蠕动泵前管路最佳长度为30 cm。

2.2.2 蠕动泵流速选择 蠕动泵的流速是影响试验的重要参数。由图3可知，在流动注射过程中，在泵速13 mL/min时，化学发光强度达到最大值，在泵速较慢或较快的情况下，化学发光强度偏低。原因可能是当泵速较慢时，化学发光反应已经在流路中发生，因此检测器捕捉不到或只能捕捉到较小的发光信号；当泵速过快时，溶液没有完全发生反应而被流走，因此得到最佳泵速为13 mL/min。

图2 紫外-可见吸收光谱图Figure 2 UV-Vis absorption spectrum of CL system

图3 蠕动泵流速的选择Figure 3 Selection of peristaltic pump flow rate

2.3 表面活性剂的选择

表面活性剂具有增溶、提高灵敏度、改变溶液介电常数和增强体系稳定的作用[25]。由表1可知，在DON 0.2 mg/L时，吐温80、卵磷脂、SDS和CTAB对鲁米诺—过氧化氢体系有增敏作用，吐温80增敏效果最为显著。CTAB在反应过程中出现白色沉淀，可能是由于反应的产物不能溶解于该体系，这与文献[26]报道一致。因此选择吐温80作为该体系的增敏剂。

2.4 化学发光动力学曲线

鲁米诺—过氧化氢的化学体系见图4。在鲁米诺—过氧化氢体系中加入DON，化学发光强度增加，说明DON对该体系有促进作用。吐温80作为增敏剂，添加到鲁米诺—过氧化氢—DON体系中，有显著促进作用，因此，试验选择鲁米诺—过氧化氢—吐温80体系对DON进行检测。

表1 表面活性剂对DON的化学发光强度的影响Table 1 Effect of surfactants on chemiluminescence of DON

图4 化学发光动力学曲线Figure 4 Curve of the chemiluminescence system

2.5 单因素试验

2.5.1 氢氧化钠浓度的选择 在碱性条件下，鲁米诺发生化学发光反应，因此采用氢氧化钠作为碱溶液[27]。由图5可知，当氢氧化钠浓度为0.02 mol/L时，化学发光强度最大，随后发光强度降低，可能加入吐温80以后，在静电作用和胶束作用下，溶液中的氢氧根离子被局部富集，胶束中的碱性增强，反应所需的pH降低[25]。因此选择0.02 mol/L为氢氧化钠的最适浓度。

图5 氢氧化钠浓度与化学发光强度的关系

Figure 5 Relationship between sodium hydroxide concentration and chemiluminescence intensity

2.5.2 鲁米诺浓度的选择 鲁米诺浓度对化学发光强度的影响见图6，在鲁米诺浓度2×10-4～8×10-4mol/L时，化学发光强度随鲁米诺浓度增大而增强，当鲁米诺浓度为8×10-4mol/L时，化学发光强度达到最大，因此选择鲁米诺浓度为8×10-4mol/L。

2.5.3 过氧化氢浓度的选择 过氧化氢在化学发光体系中作为氧化剂，直接影响发光强度。如图7所示，体系的发光强度随过氧化氢浓度先升高再降低，在过氧化氢浓度为0.6 mol/L 时，化学发光强度达到最大值，可能由于在碱性条件下，过氧化氢易分解形成阴离子，同时，鲁米诺以阴离子的形式存在，离子在吐温80表面聚集，导致周围离子浓度升高，反应速率会提升，所以发光强度迅速升高，而浓度过高会产生抑制作用，导致发光强度的降低。因此，选取0.6 mol/L 为过氧化氢最适浓度。

图6 鲁米诺浓度与化学发光强度的关系

Figure 6 Relationship between luminol concentration and chemiluminescence intensity

图7 过氧化氢浓度与化学发光强度的关系

Figure 7 Relationship between hydrogen peroxide concentration and chemiluminescence intensity

2.5.4 吐温80浓度的选择 由图8可知，发光强度随着吐温80浓度的增加而上升，当吐温80浓度达到8%时，化学发 光强度达到最大，随后发光强度迅速下降，其原因可能是浓度过高的吐温80改变了化学发光的微环境，并且吐温80浓度增加，黏稠度增加，不利于鲁米诺与过氧化氢的混合，导致发光强度的降低。因此，选择吐温80最适浓度为8%。

图8 吐温80浓度与化学发光强度的关系

Figure 8 Relationship between Tween 80 concentration and chemiluminescence intensity

2.6 响应面试验结果

2.6.1 响应面模型建立 根据单因素试验结果，以氢氧化钠浓度、鲁米诺浓度、过氧化氢浓度、吐温80浓度4个因素为自变量，以化学发光强度为响应值，进行响应面的分析试验。试验方案和结果分别见表2、3。

2.6.2 多元二次响应面回归模型建立与分析 对表3试验结果通过Design-Expert软件程序进行二次回归响应面分析， 建立多元二次响应面模型：

表2 响应面优化试验的因素和水平Table 2 Factors and levels of response surface design

表3 响应面试验设计及结果Table 3 Response surface experimental design and results

Y=-1.612 96×107+5.827 54×107A-1.128 89×109B+3.644 39×106C+3.54 120×1010D+5.301 97×107AB+4.152 60×106AC+1.964 75×109AD+8.716 33×107BC+4 108.333 33CD-3.343 38×109A2-8.698 98×1011B2-5.944 02×106C2-2.360 98×105D2。

(1)

表4为回归方程分析结果。模型P=0.000 2<0.010 0，表明该拟合模型极显著。失拟项为P=0. 390 5>0.050 0，即模型失拟度不显著，说明该方程对试验的拟合程度好，具有较高的准确度，可用于给定条件下化学发光强度的测量。而模型中一次项A的P值<0.01，说明氢氧化钠浓度对试验结果影响极显著，交互项中BC的P值<0.05，说明鲁米诺浓度与过氧化氢浓度交互作用显著。

2.6.3 响应面分析 图9中(a)～(f)直观反映了任何两个因素交互作用对化学发光强度的影响。由图9可知，氢氧化钠浓度对应的响应面坡面坡度相对陡峭，说明其对发光强度影响较大。这与表4中的分析结果一致。

2.6.4 响应面中最优检测条件预测和验证 通过软件的最优化预测功能，得到理论上的最佳检测条件：氢氧化钠浓度0.02 mol/L，鲁米诺浓度1×10-3mol/L，过氧化氢浓度0.7 mol/L，吐温80浓度8.13%，该条件下化学发光强度为465 378。为满足实际操作需求，将检测条件调整：氢氧化钠浓度0.02 mol/L，鲁米诺浓度1×10-3mol/L，过氧化氢浓度0.7 mol/L，吐温80浓度8%。在此条件下进行5次平行检测试验，得到化学发光强度平均值为459 116.3，与预测值相比，相对标准差为2.9%。因此响应面建立的模型真实可靠，可用于脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测。

2.7 标准曲线、精密度及检出限

在优化试验条件下，以DON浓度为横坐标，化学发光强度为纵坐标绘制标准曲线(图10)。试验结果表明， DON浓度在0.001～4.000 mg/L时，具有良好的线性关系，线性方程：y=55 903.54x+426 996.48，R2=0.998。同时对0.2 mg/L 的DON进行11次平行测定，相对标准差(RSD)为1.89%。根据IUPAC的规定，计算出检出限为0.001 mg/L。

2.8 加标回收试验结果

以屈臣氏蒸馏水、实验室自来水在试验优化条件下测定样本中DON含量，再通过加入标准样品测定回收率，结果见表5。加标回收率为67.33%～94.50%，自来水回收率较差，原因可能是自来水中含有次氯酸根离子与部分的鲁米诺发生反应，导致鲁米诺被消耗，检测到的发光强度降低。此外还存在一些金属离子对发光体系的干扰，为了消除干扰作用，根据本课题组之前的研究结果，可以在每100 mL样品溶液中添加0.007 5 mg的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)作为掩蔽剂[19]。

图10 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的标准曲线Figure 10 Calibration graphs for DON表4 回归方程方差分析结果†Table 4 Analysis of variance from regression equation

方差来源自由度平方和均方F值P值显著性模型145.151×10113.679×10107.850.000 2**A15.739×10105.739×101012.250.003 5**B12.881×1092.881×1090.610.446 0C11.041×10101.041×10102.160.163 4D15.845×1095.845×1091.250.282 8AB12.044×10102.044×10104.360.055 5AC11.061×10101.061×10102.270.154 5AD11.724×1091.724×1090.370.553 7BC13.092×10103.092×10106.600.022 3*BD11.219×1091.219×1090.260.618 0CD16.752×1056.752×1051.441×10-40.990 6A211.971×10101.971×10104.210.059 5B211.208×10101.208×10102.580.130 6C213.487×10103.487×10107.440.016 3*D213.680×10113.680×101178.550.000 1**残差146.558×10104.658×109失拟项105.124×10105.124×1091.430.390 5纯误差41.434×10103.585×109总和285.807×1011

† *表示差异显著，P<0.05；**表示差异极显著，P<0.01。

图9 4种因素交互作用的响应面分析结果Figure 9 Response surface analysis of interaction of four factors表5 样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的加标回收率试验Table 5 Results for the determination of DON in water sample(n=3)

样品加标量/(mg·L-1)检出值/(mg·L-1)回收率/%RSD/%自来水0.00.0000.20.134±0.00067.332.344.03.002±0.01075.550.25屈臣氏蒸馏水0.00.0000.20.189±0.00394.501.084.03.620±0.01090.610.33

3 结论

本试验利用DON对鲁米诺-过氧化氢体系的促进作用，建立了一种流动注射化学发光检测DON的新方法。与现有检测方法相比，流动注射化学发光法具有操作简便、快速、效率高、在线连续检测等优点，可应用于DON突发性水污染快速检测。目前，流动注射化学发光法只能监测单一的物质，不能检测混合物。后续可通过质谱、核磁等技术手段对化学发光反应机理作进一步探究，以期解决混合物检测的问题。