不同逆境胁迫下杉木Mn-SOD基因表达1)

饶丽莎　王培　张家君　黄田盛　　　 许珊珊　曹光球　林思祖

(福建农林大学, 福州,350002)　　　　　　　　(国家林业局杉木工程技术研究中心(福建农林大学林学院))

杉木(Cunninghamialanceolata(Lamb．) Hook．)是我国南方重要的速生用材树种[1]。我国一些杉木主产区常年夏季高温少雨，冬季寒冷干燥，极端低温和干旱现象频发且土壤富铁铝化严重[2]。因此，杉木在生长过程中经常遭受各种逆境胁迫(铝毒害、低温和干旱等)，此类环境因素限制了杉木的生长。逆境胁迫容易引起植物体内活性氧代谢失衡，导致植物体内活性氧大量积累造成氧化损伤，最终使植物生长受抑。逆境胁迫下，为保护细胞免受活性氧的伤害，植物在长期进化过程中，建立了一套酶促和非酶促系统组成的抗氧化体系。超氧化物歧化酶(SOD)作为酶促抗氧化系统中重要的组成部分，在清除植物体内超氧阴离子自由基，减轻其对细胞的损伤，维持细胞膜的结构和功能中起着十分关键的作用[3]。SOD是一类广泛存在于植物体内的金属酶类，根据金属辅基的不同通常将SOD分为3种不同的类型，即Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD[4]。研究表明在这3种不同类型的SOD中，Mn-SOD在清除活性氧中尤为关键，是需氧生物生存必不可缺的一种SOD，与植物众多抗逆性密切相关[5-6]。研究发现烟草Mn-SOD基因转化苜蓿(MedicagosativaLinn)植株，Mn-SOD活性显著提高[7]。类似的研究结果在水稻[8]中也有发现，因此Mn-SOD基因对于清除活性氧维持植物正常生理功能具有重要意义。近年来在芥菜(Brassicajuncea(L.) Czern. et Coss.)[9]、茄子(SolanummelongenaL.)[10]、茶树(Camelliasinensis)[11]、小麦(TriticumaestivumL.)[12]、银杏(GinkgobilobaL.)[13]、莲(NymphaeaL.)[14]等植物中克隆获得Mn-SOD基因并进行了逆境胁迫下的表达分析，进一步证实了Mn-SOD基因在调控植物对逆境胁迫耐性中具有重要作用。

目前对杉木Mn-SOD基因在逆境胁迫下的分子机理未见报道。鉴于此，本研究根据已克隆的Mn-SOD基因序列，运用qRT-PCR技术探究不同逆境胁迫下杉木Mn-SOD基因的表达情况，为进一步探究杉木Mn-SOD基因在逆境胁迫中的功能及抗逆育种的分子机制提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　植物材料

以杉木020组培苗作为试验材料，选取长势大小一致的组培苗接种到MS液体培养基中，培养温度25 ℃，湿度70%，光照周期为16 h光照/8 h黑暗，有效光辐射150 μmol·m-2·s-1。预培养1周后分别用4 ℃低温、0.054 6 g·mL-1甘露醇、2 mmol·L-1铝离子和300 mmol·L-1的NaCl进行胁迫。采用3组重复试验，取在未处理(CK)和胁迫培养下不同时间点的组培苗(低温胁迫0、6、12、24、48、96 h；干旱胁迫0、12、24、48 h；铝胁迫0、6、12、24、48 h；盐胁迫0、12、24、48 h)，取成熟未处理的杉木组培苗的根、茎和叶，用于组织特异性表达。液氮冷冻后保存于-80 ℃冰箱备用。

1.2　总RNA的提取和cDNA的合成

取100 mg杉木组培苗加入液氮迅速研磨，直至研磨成粉末状，采用天根公司的多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取总RNA。利用紫外分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。采用TaKaRa生物公司的PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行cDNA第一链合成。

1.3　qRT-PCR分析

试验以杉木Actin为内参基因，设计引物F1：5’-CAGCAACTGGGATGATATGG-3’，R1：5’-ATTTCGCTTTCAGCAGTGGT-3’；根据扩增得到的杉木Mn-SOD基因设计引物F2：5’-TGACAGCCACTGTCTTGAAA-3’，R2：5’-ACTATTAAACCTCTCTGCCAGTT-3’。

qPCR反应采用TaKaRa生物公司的SYBR®Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)试剂盒，在ABI7500荧光定量PCR仪上进行试验。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，40个循环。

1.4　数据处理

选用2-ΔΔCT法对目的基因的相对表达量进行计算。其中：ΔΔCT=(试验组ΔCT)-(对照组ΔCT)；试验组ΔCT=(试验组目的基因CT)-(试验组内参基因CT)[15]。

2　结果与分析

2.1　杉木总RNA检测

提取各胁迫处理的杉木总RNA，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。RNA3条带完整，28S的亮度为18S的2倍，5S的亮度最淡。OD值均在1.8～2.0，可知样品总RNA完整性好，可进行后续cDNA合成试验。

M为2000DNA相对分子质量标准；1为总RNA。

2.2　杉木Mn-SOD基因的表达量

2.2.1不同胁迫下杉木Mn-SOD基因的表达

由表1可知，与对照组相比，短时间(6 h)低温胁迫(4 ℃)处理能诱导Mn-SOD基因相对表达量增加；随胁迫时间延长，Mn-SOD基因相对表达量呈现出先增加后降低的趋势，当低温胁迫时间达到12 h时，Mn-SOD基因相对表达量达到峰值，此时Mn-SOD基因相对表达量是对照的47.94倍。继续延长胁迫时间至96 h内，Mn-SOD基因相对表达量则出现急剧下调，尽管此时Mn-SOD相对表达量下降，但仍显著高于对照处理，是对照组的18.65倍。

在干旱胁迫下，随时间的推移，Mn-SOD基因的相对表达量呈先上升后下降的趋势。12 h时Mn-SOD基因相对表达量出现急剧上调且显著高于对照组，是对照组的3.29倍。处理24 h时相对表达量降低至对照组的0.85倍，继续延长胁迫时间至48 h，Mn-SOD基因的相对表达量仍呈下降趋势，是对照组的0.64倍。

经2 mmol·L-1铝离子胁迫，Mn-SOD基因的相对表达量随着时间延长总体呈现上升的趋势，且均显著高于对照组的相对表达量。短时间(6 h)铝胁迫就能诱导Mn-SOD基因表达量增加，当铝胁迫时间达到24 h的时候Mn-SOD基因表达量达到峰值，此时Mn-SOD基因表达量是对照的22.21倍。继续延长胁迫时间至48 h，Mn-SOD基因表达量呈现下调的趋势，尽管此时Mn-SOD表达量下降，但仍显著高于对照处理。

盐胁迫可在一定程度上破坏植物体内的离子平衡和渗透压，从而引起植物体内代谢紊乱，导致活性氧积累，从而造成自由基伤害。杉木组培苗中Mn-SOD基因表达量在48 h内呈显著上升的趋势，相对表达量均显著高于对照组，12～24 h时Mn-SOD基因的相对表达量是对照的9倍左右，在48 h时Mn-SOD基因相对表达量达到峰值，此时Mn-SOD基因表达量是对照的33.88倍。

表1　不同胁迫下杉木Mn-SOD基因相对表达量

注：不同小写字母表示处理间显著性水平P<0.05。

2.2.2杉木Mn-SOD基因的组织特异性表达

Mn-SOD基因在成熟未处理的杉木根、茎和叶中均有表达，但相对表达量存在显著差异。Mn-SOD基因在叶中表达水平最高，茎的相对表达量次之，在根中的相对表达量最低。将根中的Mn-SOD基因相对表达量作为对照，茎中的相对表达量为根的3.96倍，叶片中的相对表达量为根的4.93倍(表2)。

表2　杉木Mn-SOD基因在不同组织部位的相对表达量

注：不同小写字母表示处理间显著性水平P<0.05。

3　讨论与结论

在正常生长条件下，植物体内活性氧自由基的产生和清除始终保持着动态平衡，当植物遭受外界胁迫时，这种动态平衡就会被打破，从而导致活性氧迅速积累。当活性氧累积超过植物自身调节能力时，就会发生膜脂过氧化并引发连锁反应，导致细胞膜系统受损，细胞内组分外渗，引起代谢紊乱。为保护细胞免受活性氧的损害，在长期进化过程中植物建立一套由酶性抗氧化系统(如超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶等)和非酶性抗氧化系统(如抗坏血酸和谷胱甘肽)组成的抗氧化防御体系[16]。超氧化物歧化酶是清除活性氧的第一道防线，主要催化超氧物阴离子自由基(O2-)歧化形成过氧化氢(H2O2)，随后在过氧化物酶和过氧化氢酶的作用下形成水，保护细胞免受伤害[17-18]。超氧化物歧化酶活性与植物的耐氧化性、耐旱性之间呈正相关，且受到相应超氧化物歧化酶基因的表达调控。植物转基因试验研究发现，柽柳(TamarixchinensisLour.)中克隆的Mn-SOD基因转化到酵母基因组中，其抗干旱、高温能力明显提高[19]。转Mn-SOD基因仙客来(Cyclamenpersicum)植株对高温胁迫的抗性也有所提高[20]。相同的结果在西伯利亚蓼(PolygonumsibiricumLaxm.)中也发现，其PsMnSOD基因提高了酵母对盐碱胁迫的抗性[21]。

本研究通过实时荧光定量PCR发现低温胁迫下杉木组培苗中Mn-SOD基因表达也受到迅速诱导(6 h)，在12 h时达到峰值，随后其表达量迅速下降。导致基因Mn-SOD表达量出现下调的原因可能就是由于长时间低温胁迫导致杉木组培苗不可逆损伤，造成其抗寒能力下降。在48 h时Mn-SOD基因的表达量与对照差异不显著，可能由于低温胁迫基因响应时间较短，胁迫时间过长等原因，这与在研究低温下茄子SmMnSOD基因的表达受到显著抑制的结果相一致[10]。同时前人研究结果也表明，低温胁迫能显著诱导植物体内SOD基因的迅速表达，增强植物对低温胁迫的抗性[22]。除了低温胁迫可以迅速诱导Mn-SOD基因表达，其他逆境胁迫同样可诱导表达，例如茶树[11]和小麦[12]在干旱胁迫和盐胁迫下均能显著诱导Mn-SOD基因快速表达，呈现上调趋势。与前人研究结果类似，本研究中发现随干旱胁迫时间的延长，杉木组培苗Mn-SOD基因表达量增加，12 h时表达量达到最高且显著高于对照；24 h后表达量显著降低，可推测杉木Mn-SOD基因在干旱胁迫一定时间内能对杉木起到调节保护作用。而这种随着胁迫时间延长表达量下降的情况，可能是由于杉木自身较为敏感，长时间胁迫处理使其体内活性氧过量积累造成严重损失，引起细胞各部位代谢紊乱，从而最终引起该基因表达量下降。众所周知，铝胁迫迅速诱导活性氧在植物体内积累，导致氧化损伤，抑制植物生长。类似地，铝胁迫下杉木组培苗Mn-SOD基因表达量同样呈上升趋势，而且其表达量均高于对照，说明Mn-SOD基因在杉木应对铝胁迫过程中具有一定的作用。盐胁迫下杉木组培苗Mn-SOD基因表达量变化幅度最大，胁迫48 h表达量上升33.88倍。由此可见，不同逆境胁迫均能快速诱导杉木Mn-SOD基因表达，而不同的胁迫方式调控机制不同，导致对胁迫的响应时间和响应程度不同。低温和干旱胁迫可以较快地诱导Mn-SOD基因的表达，均在12 h时相对表达量达到峰值，Mn-SOD基因在铝胁迫下的表达量是波动的，在24 h时相对表达量达到峰值，而Mn-SOD基因响应盐胁迫时间要长于其他3种胁迫，在48 h达到峰值且显著高于对照组。

同时本研究通过实时荧光定量PCR分析Mn-SOD基因在杉木组培苗根、茎和叶组织中的表达差异，丰富了Mn-SOD基因的表达规律。研究发现Mn-SOD基因在根、茎和叶均有表达。其中，Mn-SOD基因在杉木叶片有较高的表达，而茎和根的表达量相对较低。前人研究表明，茄子(SolanummelongenaL.)中SmMnSOD基因在多个组织中均有表达，其中叶片和花瓣中的表达量最高[10]；杧果(Mangiferaindica)MiMnSOD基因在多个组织中表达，其中在成熟叶片和果实中表达水平最高[23]。

本研究证实了杉木Mn-SOD基因能对不同逆境胁迫条件产生响应，暗示在逆境胁迫下，当植物体内细胞受到伤害时，杉木可能通过诱导Mn-SOD基因的表达，从而减轻逆境胁迫对杉木造成的伤害。研究结果为通过基因工程手段改良杉木抵抗逆境胁迫能力，增强杉木对逆境胁迫的耐性提供理论依据。