白桦BpbHLH2和BpbHLH3基因克隆及表达模式1)

王思瑶　李欣　孙璐　杨杰　李影　崔曈肸　詹亚光　尹静

(林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)，哈尔滨，150040)

白桦(BetulaplatyphyllaSuk.)属桦木科桦木属，为落叶乔木，其具有适应力强、生长快速、材质优良的特点，是我国东北地区多种地带性植被的先锋树种[1]。白桦中含有丰富的三萜类物质[2]，例如桦叶烯三醇、白桦酯酸及白桦酯醇等。有研究显示白桦酯酸可以抑制H9淋巴细胞中HIV病毒复制和选择性地抑制黑色素瘤细胞的生长[3-4]，其毒性低、疗效高、抗性强、作用广的特点成为潜力巨大、应用前景广阔的新型药物制剂[5-8]。

植物合成三萜类物质往往不是由单个基因决定的，而是由多基因控制的数量性状。因此，通过分离和鉴定与三萜类合成有关的转录因子，调控三萜代谢多个基因表达，综合提高植物三萜类物质的产量，已成为现在植物诸多研究工作者的主要方向。bHLH(basic Helix-Loop-Helix)是植物中广泛存在的一类重要转录因子，其结构域约有60个氨基酸，包含碱性区域和螺旋-环-螺旋(HLH)区域，bHLH转录因子通过两个A-螺旋之间的相互作用，形成同源或异源二聚体，与靶基因启动子的G-box相结合，从而调控靶基因的表达[9]。对植物中分离得到的638个(水稻、葡萄、拟南芥等)bHLH转录因子进行了分类，共32个亚家族，这些bHLH蛋白在植物生长发育、信号转导和次生代谢调控中起重要作用[10]。但目前对bHLH功能研究在动物中进展较快，而植物bHLH转录因子家族的功能只有部分得到解析[13-14]。植物激素茉莉酸(Jasmonic Acid,JA)和水杨酸(Salicylic Acid,SA)作为诱导子，不仅对植物的生长发育及防御有着重要的调节和控制作用[15]，且在植物次生代谢产物合成中扮演着重要角色，二者可以显著刺激抗逆酶活性的提高，并促进黄酮、萜类等的生物合成及相关途径的基因表达[16-24]。李春晓[23]的研究显示MeJA(茉莉酸甲酯)和SA处理对白桦幼树三萜积累的诱导主要表现在早期，不同浓度MeJA及SA处理总体上促进了白桦叶片中总三萜的积累。中科院陈晓亚团队以拟南芥为实验材料，明确了bHLH类转录因子参与激活JA信号途径，调节植物的生长发育及抗逆防御反应，并在拟南芥腺毛的萜类合成中发挥重要作用[24]。

基于本实验室前期研究结果，SA和JA均可以显著提升三萜含量及促进相关基因的表达[19-20]，但不同bHLH转录因子对两种信号的响应表达存在差异(待发表)，这说明不同的bHLH转录因子在参与JA、SA信号诱导及调控萜类合成所扮演的角色不同。本研究通过对实验室前期筛选的白桦中响应MeJA和SA诱导的BpbHLH2、BpbHLH3基因进行克隆及表达模式分析，为阐明该基因在白桦生长发育及三萜类物质合成中的作用奠定重要的基础。

1　材料与方法

实验材料来自东北林业大学生命学院森林生物工程实验室培养的白桦组培苗。

IPTG，X-gal，LB培养基，ExTaqDNA聚合酶，dNTPs，pMD18-T克隆载体，SYBR® Premix ExTaqTM(Perfect Real Time)，Takara Prime Script TM II 1st Strand cDNA Synthesis kit，DH-5α感受态细胞，均购于宝生物工程有限公司，DNA纯化回收试剂盒购于OMEGA公司，PCR引物合成及DNA测序由哈尔滨博仕生物科技有限公司完成。白桦组培苗总RNA提取及DNA消化(Tris-CTAB法)参考粱甜[25]方法。

1.1　白桦cDNA的合成

采用Takara公司的反转录试剂盒合成第一条链cDNA，于-20 ℃保存备用。

1.2　BpbHLH2、BpbHLH3基因克隆及鉴定

根据实验室前期转录组测序获得的序列，将其进行ORF-Finder分析，并设计特异性引物，引物F、R见表1，将获得的cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系、目的片段回收、纯化、连接及转化参考粱甜[25]的实验方法，需要注意的是BpbHLH2、BpbHLH3基因PCR扩增时的退火温度为55 ℃，延伸时间为2 min。

1.3　BpbHLH2、BpbHLH3基因生物学信息

利用NCBI、ExPASy、GOR4、Phyre2等生物信息网站，以及BIOEDIT、MEGA5等生物信息软件对获得的白桦BpbHLH2基因和BpbHLH3基因的全长cDNA序列及所编码的氨基酸序列进行分子特征、理化性质、同源性和系统进化等一系列分析预测。

表1　BpbHLH2、BpbHLH3基因克隆及定量分析引物

1.4　BpbHLH2、BpbHLH3基因表达

按照“1.2”的方法提取寄代4周的白桦组培苗的根、茎、叶中RNA，进行组织特异性分析；于2016年6—9月每月15号上午09：00时，于东北林业大学盆栽试验场取统一栽培的3年生白桦植株叶片。取位于各株白桦植株中上部生长旺盛的叶片，每株各取10片混合，液氮速冻保存，待进行不同月份基因表达量分析。以白桦微管蛋白(TU)基因为内参，使用BpbHLH2、BpbHLH3基因荧光定量PCR引物(见表1)，以不同组织cDNA为模板，进行定量RT-PCR检测(QRT-PCR)。具体程序及方法按照Takara公司的SYBR Premix EXTaqTM(Perfect Real Time)的试剂盒说明书进行操作。PCR扩增程序如下：预变性95 ℃、30 s，1个循环；95 ℃、5 s，60 ℃、35 s，95 ℃、15 s共40个循环；60 ℃、1 min，1个循环；95 ℃、15 s，1个循环。每个反应3个重复。所有处理及测量均3次重复。利用SPSS软件对不同处理获得数据进行邓肯方差分析。

2　结果与分析

2.1　BpbHLH2、BpbHLH3基因的克隆

根据白桦转录组数据库中基因已知bHLH2、bHLH3序列的两端设计特异引物，以白桦总RNA的反转录产物为模板，进行RT-PCR扩增。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，分别检测到特异扩增条带，如图1、2。测序结果显示，PCR产物长度分别为1 438、1 355 bp，暂命名为BpbHLH2、BpbHLH3。

2.2　BpbHLH2、BpbHLH3全长序列生物信息学

2.2.1BpbHLH2、BpbHLH3基因分子特征

BpbHLH2含完整的ORF，核酸序列长为1 050 bp，编码349个氨基酸。将此预测的cDNA全长序列利用BLASTp进行序列比对，发现该氨基酸序列与胡桃(JuglansregiaL.)bHLH家族蛋白(GenBankID:XP_018817560.1)相似度为71%；转录因子BpbHLH3基因cDNA，含完整的ORF，核酸序列长为1 044 bp，编码347个氨基酸。将此预测的cDNA全长序列利用BLASTp进行序列比对，发现该氨基酸序列与胡桃(JuglansregiaL.)bHLH家族蛋白(GenBankID:XP_018813766.1)相似度为70%。

M.DL2000；1为BpbHLH2基因扩增产物。

M.DL2000；1无样品，2为BpbHLH3基因扩增产物。

BpbHLH2、BpbHLH3蛋白质分别在696～842 aa、609～752 aa有螺旋-环-螺旋的DNA结合保守结构域，并且其附近均存在E-box和N-box位点。BpbHLH2氨基酸序列相对分子质量为38 503.50，等电点为7.63，总平均疏水性为-0.497，具有亲水性，不稳定系数为51.54，该蛋白为不稳定蛋白；BpbHLH3氨基酸序列分子质量为38 789.67，等电点为6.41，总平均疏水性为-0.517，具有亲水性，不稳定系数为46.04，该蛋白为不稳定蛋白。BpbHLH2氨基酸在第197位置处疏水性最强，达2.300，在186、187、189的位置具有最强的亲水性，为-2.811，分布在0.5以上的峰值少于分布在-0.5以下的，说明该蛋白为亲水蛋白；BpbHLH3氨基酸在第191位置处疏水性最强，数值为2.333，在180、181、182的位置具有最强的亲水性，可达-2.811，分布在0.5以上的峰值少于分布在-0.5以下的，说明该蛋白为亲水蛋白。BpbHLH2编码的蛋白质存在2个跨膜螺旋，并预测在第150～168个氨基酸链是由内向外跨膜，第301～318个氨基酸是由外向内跨膜；BpbHLH3编码的蛋白质存在2个跨膜螺旋，并预测在第303～324个氨基酸链是由内向外跨膜，在第303～322个氨基酸链是由外向内的跨膜。BpbHLH2蛋白由32.38%的α螺旋、50.72%的无规则卷曲和16.91%延伸链组成；BpbHLH3蛋白由31.99%的α螺旋、50.14%的无规则卷曲和17.87%延伸链组成。

2.2.2BpbHLH2、BpbHLH3氨基酸序列同源性

将BpbHLH2编码的氨基酸分别与胡桃(JuglansregiaL. XP_018817560.1)、木薯(ManihotesculentaCrantz. OAY33546.1)、甜樱桃(Cerasusavium(L.) Moench. XP_021829526.1)、桃树(PrunuspersicaL. ONI02641.1)、巴西橡胶树(Heveabrasiliensis(Willd. ex A. Juss.) Muell. Arg XP_021692404.1)、苹果(MalusdomesticaMill. XP_017192897.1)、白梨(PyrusbretschneideriRehd. XP_009354636.1)、梅(PrunusmumeSieb. XP_008236887.1)、蓖麻(RicinuscommunisL. XP_002528912.2)、枣(ZiziphusjujubaMill. XP_015890448.1)、野草莓(FragariavescaXP_011466492.1)、可可(TheobromacacaoXP_017971736.1)、雷蒙德氏棉(GossypiumraimondiiUlbr. XP_012492040.1)、麻风树(JatrophacurcasL. XP_012079597.1)、木本棉(GossypiumarboreumLinn. XP_017629129.1)的bHLH转录因子氨基酸序列进行了Clustal W法同源性比较，结果显示，其BpbHLH2所编码的蛋白质与各物种的bHLH转录因子序列具有相似性，且大部分序列具有保守性(图3)。其中，BpbHLH2转录因子与胡桃、木薯bHLH转录因子同源性较高，其氨基酸序列相似性分别达到了71%和65%。据此，我们推断白桦BpbHLH2可能是bHLH转录因子家族中的新成员，但其功能有待于进一步的鉴定。

将白桦BpbHLH3编码的氨基酸分别与胡桃(JuglansregiaL. XP_018813766.1)、可可(TheobromacacaoEOX91822.1)、梅(PrunusmumeSieb. XP_008236876.1)、陆地棉(GossypiumhirsutumLinn. XP_016723306.1)、甜樱桃(Prunusavium(L.) Moench. XP_021829516.1)、野草莓(FragariavescaXP_004288301.1)、桃树(PrunuspersicaL. ONI02640.1)、苹果(MalusdomesticaMill. XP_008383369.1)、雷蒙德氏棉(GossypiumraimondiiUlbr. KJB18117.1)、白梨(PyrusbretschneideriRehd. XP_009347092.1)、木本棉(GossypiumarboreumLinn. KHG02490.1)、巴西橡胶树(Heveabrasiliensis(Willd. ex A. Juss.) Muell. Arg XP_021655264.1)、木薯(ManihotesculentaCrantz. OAY33545.1)、麻风树(JatrophacurcasL. KDP32145.1)、甜橙(Citrussinensis(L.) Osbeck XP_006466576.1)的bHLH转录因子氨基酸序列进行了Clustal W法同源性比对，结果显示其白桦BpbHLH3所编码的蛋白质与各物种的bHLH转录因子序列具有较高的相似性，且大部分序列具有保守性(图4)。其中，BpbHLH3与胡桃、可可bHLH转录因子同源性较高，其氨基酸序列相似性分别达到了70%和62%。据此，我们推断白桦BpbHLH3也是bHLH转录因子家族中又一新成员。

图3　白桦BpbHLH2编码蛋白与其他植物bHLH基因编码蛋白的相似性

为了进一步研究白桦BpbHLH2、BpbHLH3蛋白与其他bHLH类蛋白的亲缘关系，构建了系统进化树，如图5。结果表明，随着物种不同，它们之间遗传距离存在显著差异。白桦的BpbHLH2、BpbHLH3转录因子分别单独在一个分支上。BpbHLH2、BpbHLH3与胡桃的bHLH转录因子亲缘性较其他物种高，进一步表明本研究获得的白桦BpbHLH2、BpbHLH3基因是bHLH家族中的新成员，为编码bHLH转录因子蛋白的2个新基因。

2.3　BpbHLH2、BpbHLH3基因的表达特征

2.3.1不同月份BpbHLH2、BpbHLH3基因相对表达量

如表2所示，BpbHLH2基因在叶片中的表达在8月份高于其它月份，其中8月份表达为6月的1.94倍，9月表达量最低；而BpbHLH3在7、8、9月表达量显著高于6月，其中9月最高，是6月的30.17倍。研究结果表明两个基因在不同月份的表达模式存在差异。

2.3.2BpbHLH2、BpbHLH3组织特异性

分析表明，BpbHLH2基因在根中的表达量最低，在叶中的表达量相对最高，是根中的1.74倍，二者差异显著；BpbHLH3基因在叶中的表达量最高，其次为根、茎，其中叶中表达量是茎中的5.15倍，达显著差异(表3)。

图4　白桦BpbHLH3编码蛋白与其他物种bHLH基因编码蛋白的相似性分析

图5　白桦BpbHLH2、BpbHLH3氨基酸序列系统进化树

表2　不同月份白桦叶中BpbHLH2、BpbHLH3相对表达

注：表中同列不同小写字母表示不同处理在p<0.05水平上差异显著。

表3　白桦不同组织中BpbHLH2、BpbHLH3相对表达量

注：表中同列不同小写字母表示不同处理在p<0.05水平上差异显著。

3　结论与讨论

本研究基于前期对东北白桦转录组测序结果，并结合实验室前期筛选的响应MeJA和SA信号的bHLH转录因子基因，克隆得到两条bHLH家族基因，分别命名为BpbHLH2、BpbHLH3，生物信息学分析显示，为白桦新的bHLH家族基因。BpbHLH2、BpbHLH3均存在螺旋-环-螺旋的DNA结合保守结构域，同时序列同源分析及分子进化树构建结果也显示BpbHLH2、BpbHLH3蛋白很可能为白桦bHLH家族中的新成员，其功能未知。

MYC2作为bHLH转录因子家族之一，为JA信号途径的主要调控因子[26-28]。在长春花悬浮培养细胞中，JA可以诱导CrMYC1、CrMYC2 mRNA的表达，并且在JA应答中，CrMYC2的下调对生物碱的积累影响显著[29]；GL3是bHLH家族的转录因子，其过量表达大幅度提高了中药中有效成分的含量[30]；在橡胶树乳管细胞中，JA分子可能通过对bHLH等转录因子基因表达的激活作用，启动橡胶生物合成相关基因的表达，从而提高细胞的乳胶产量[31-32]。可见，在植物JA信号转导途径中，bHLH转录因子起着“主开关调节子”作用，通过启动一系列相关基因的表达从而产生JA诱导的生理效应[33]。本研究前期结果显示，MeJA、SA可显著诱导白桦三萜合成途径关键基因FPS、SS、SE、BPW、BPY基因上调表达，且发现FPS、SS、SE基因启动子序列含bHLH转录因子结合位点G-box[34-35]，且MeJA和SA诱导的白桦转录组数据库结果显示BpbHLH2、BpbHLH3响应两种信号诱导，并表现不同模式(待发表)，进而推测白桦2个bHLH基因可能在MeJA或SA信号诱导三萜合成中发挥重要功能，且机制不同。萜类物质合成具有组织特异性，并受季节和环境影响，这与其基因表达特异直接相关[1,20,23]。白桦叶中具有较丰富的达玛烷三萜和齐墩果酸物质，且相关的三萜合成途径基因也受激素诱导表达上调[19,23]，本研究发现两个转录因子基因均在叶片中高表达，是否其也参与调控相关激素对三萜的调控，有待进一步通过该转录因子及其三萜合成基因的启动子序列克隆及顺式作用元件分析验证。同时本研究也发现两个基因表达分别在8月和9月达最高，而研究显示bHLH基因启动子序列含有温度胁迫响应元件[35]，八月为哈尔滨夏季，温度较高，而9月温度开始下降，推测两个基因对温度变化存在不同响应。本研究BpbHLH2、BpbHLH3基因的cDNA全长序列克隆及生物信息学的分析，为进一步阐明该基因在白桦三萜合成途径中的重要作用奠定了基础。