藻油中DHA-EE的HPLC快速定量方法的建立

谢枫才，张　宾，孙继鹏

(1.浙江海洋大学食品与医药学院，浙江 舟山 316022；2.国家海洋局第三海洋研究所，国家海洋局海洋生物资源综合利用工程技术研究中心，福建 厦门 361005)

0　引言

二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)属ω-3多不饱和脂肪酸，是人类大脑及视网膜的重要成分。DHA具有调节人体内脂蛋白、血脂正常代谢和降血压作用，并能降低血液黏稠度和胆固醇水平，预防动脉硬化[1-4]。大量研究表明，DHA缺乏会引起婴幼儿或儿童脑部发育受阻，致使视力障碍及记忆力下降[5-6]。鱼油中富含丰富的DHA，市场上的DHA 产品主要是从深海鱼油中提取，但是鱼油易受到环境、气候等因素影响而发生劣变，目前其产量仅能满足世界需求量的60%左右[7]。

微藻在海洋中的角色为初级生产力，许多微藻能自身合成DHA，其DHA相对含量远远高于鱼油中DHA含量[8]。此外，藻油属于食物链最低端，其不含海洋污染物和胆固醇，且较为纯净、腥味小及稳定性好，产品回收率高于鱼油[9-10]。研究表明，同等剂量不同来源的DHA 对儿童记忆力的影响具有相同作用[11]，因此，藻油作为DHA的重要来源一直备受关注。DHA可分为甲酯型、乙酯型、甘油酯型和游离型4类。目前市场上DHA产品多为乙酯型，如美国FDA药品数据库收载的6个ω-3多不饱和脂肪酸[12]、美国药典(USP35)和欧盟药典(07/2012：1250)收载的ω-3多不饱和脂肪酸均为乙酯型。

对于鱼油及藻油产品中DHA的检测方法，目前主要采用气相色谱法[13-14]，但由于DHA属于长链脂肪酸，不易气化，所以检测时需在较高温度下进行且分析时间较长[15]。因此，为避免高温对DHA稳定性的影响，人们逐渐尝试采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)作为DHA含量的检测分析方法[16]。藻油中不饱和脂肪酸包含DHA和二十二碳五烯酸(docosahexaenoic acid，DPA)2类，HPLC法较难将两者进行分离，会造成DHA测定结果偏高。因此，本文针对以上问题，建立基于HPLC的藻油中DHA乙酯(docosahexaenoic acid ethyl ester,DHA-EE)的分析方法，在优化检测参数基础上，评价建立方法的精密度和准确度，旨在实现藻油样品中乙酯型DHA含量的高效快速定量分析。

1　实验方法

1.1　仪器和试剂

LC-1260型高效液相色谱仪、GC7890B气相色谱仪器、紫外检测器，美国安捷伦科技有限公司；Milli-Q型超纯水仪，密理博中国有限公司；ME104E型分析天平，德国梅特勒公司；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器，上海予华仪器设备公司。

乙酯型DHA标准品(DHA-EE，纯度>99.6%)，美国Sigma-Aldrich公司；乙酯型DPA标准品(DPA-EE，纯度>99.6%)，美国Nu-Chek公司；甲醇、正己烷(色谱纯)，德国Merck公司；无水乙醇、氢氧化钠(分析纯)，西陇科学股份有限公司；国内某品牌藻油待测样品。

1.2　色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C8(4.6 mm×250 mm)、SHIMADZU C18(4.6 mm×250 mm)、InertSustainSwift C18(4.6 mm×250 mm)；柱温为30 ℃；流动相V(甲醇)∶V(水)=80∶20，85∶15 ，90∶10；流速分别为0.5，0.8，1.0 mL/min；进样量为10 μL；检测波长为204 nm。

1.3　标准样品制备

准确称取38.4 mg DHA-EE标准品置于10 mL 容量瓶中，甲醇定容摇匀后，采用HPLC法进行分析检测。准确称取37.3 mg DHA-EE标准品置于10 mL容量瓶中，正己烷定容摇匀后，采用HPLC法检测。将DPA-EE标准品置于10 mL容量瓶中，甲醇定容摇匀，采用HPLC法进行分析检测。

1.4　藻油样品制备

在250 mL三颈烧瓶中放入藻油样品10 g，恒温水浴升温至55 ℃后，将含有0.016 g NaOH的无水乙醇(30 mL)加入三颈烧瓶中，密闭容器在恒温水浴磁力搅拌反应16 h。反应结束后，减压蒸发将乙醇去除。准确称取待测乙酯化藻油样品1.0 g于25 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀后用于HPLC分析。

2　结果

2.1　色谱柱的选择

在相同色谱条件下，DHA-EE与DPA-EE在ZORBAX SB-C8、Inert Sustain Swift C18、SHIMADZU C18色谱柱上分离及出峰情况，如图1所示。综合考虑DHA-EE与DPA-EE的分离度、保留时间和峰形等色谱因素，发现二者在 ZORBAX SB-C8色谱柱上的保留时间相对较短，色谱峰形较为对称，且DPA-EE与DHA-EE分离度为11.44，分离效果良好。因此，选用ZORBAX SB-C8色谱柱进行后续的DHA-EE与DPA-EE定量检测分析。

2.2　分离条件的选择

2.2.1检测波长的选择

考察不同波长对DHA-EE和DPA-EE分离效果、DHA-EE含量的影响，对藻油进行100～800 nm全波长扫描，结果如图2所示。当波长为204 nm时，DHA-EE分离峰可与DPA-EE及其他杂峰达到基线分离，可满足分析检测要求。DHA-EE最大吸收峰出现在波长204 nm处。综合考虑色谱分离效果及DHA-EE吸收值，选择波长204 nm进行后面的分析。

2.2.2流动相的选择

考察甲醇与水的不同配比(V∶V)对DHA-EE和DPA-EE分离效果影响，结果如图3所示。当V(甲醇)∶V(水)=90∶10时，DHA-EE分离峰可与DPA-EE及其他杂峰达到基线分离，可满足分析检测要求。该流动相条件下，其分离运行时间显著优于V(甲醇)∶V(水)=80∶20和V(甲醇)∶V(水)=85∶15这两个比例的，从而可提高实验的分析效率。综合考虑色谱分离时间及效果，选择V(甲醇)∶V(水)=90∶10作为流动相进行后面的分析。

2.2.3流速的选择

在确定流动相为V(甲醇)∶V(水)=90∶10条件下，考察不同流速(0.5，0.8，1.0 mL/min )对DHA-EE和DPA-EE分离效果影响，结果如图4所示。综合考虑DHA-EE和DPA-EE分离度、保留时间、色谱峰峰形及其他杂质峰等因素，选择流动相流速为1.0 mL/min，获得的DHA-EE和DPA-EE保留时间较为合理，且色谱峰峰形对称。

综上，DHA-EE与DPA-EE 的HPLC分析采用ZORBAX SB-C8(4.6 mm×250 mm)色谱柱，流动相为V(甲醇)∶V(水)=90∶10，流速为1.0 mL/min，检测波长为204 nm，柱温为30 ℃。

2.3　标准曲线的绘制

取不同浓度的DHA-EE标准品溶液进样HPLC检测，测定分离峰的面积响应值，建立DHA-EE回归方程为：y=39.91x+765.11(R2=0.999 2)，在0.008 1～1.92 μg范围内呈良好线性关系，进而绘制峰面积-浓度之间的相关关系，如图5所示。

2.4　精密度分析

取一定浓度的DHA-EE标准品溶液连续进样10次进行HPLC分析，通过分离峰面积响应值计算相对标准偏差为RSD=0.1%，表明仪器精密度良好(见表1)。

表1　仪器精密度试验

2.5　稳定性分析

取DHA-EE标准品溶液分别放置0，2，4，6，8，10，12，16，20，24 h后进行测定，通过峰面积响应值来计算相对标准偏差，获得DHA-EE的RSD为0.25%，表明样品在24 h内DHA-EE稳定性良好(见表2)。

表2　DHA-EE稳定性试验

2.6　定量限分析

根据仪器信噪比(S/N)小于3 为标准，DHA-EE最低定量限为7.10 ng，仪器信噪比(S/N)大于10 为标准，DHA-EE最低定量限为8.05 ng。

2.7　加标回收率测定

取不同含量的藻油样品5份，加入一定量的DHA-EE，做加标回收，结果表明，DHA-EE加标回收率平均值为102.42%，RSD为2.25%，表明加样回收率良好，结果见表3。

2.8　待测样品分析

取3份乙酯化后藻油样品，按照上述优化后方法进行HPLC检测；另外取3份相同样品，进行气相色谱(gas chromatography,GC)检测，进行对比分析。GC检测条件：进样口温度为270 ℃，总流量为30 mL/min，柱流量为1 mL/min、分流比为10∶1，色谱柱为SP-2560，检测器温度280 ℃。HPLC法对藻油中DPA-EE与DHA-EE分离效果如图6所示，测得结果见表4。可见，2种方法测得DHA-EE含量相差不大，且都能保持稳定，均可作为藻油中DHA-EE含量测定方法。但从分析效率来看，HPLC法保留时间与GC法对比，显著缩短了检测时间，提高了检测效率。因此，高效液相色谱法更优于气相色谱法。

表3　DHA-EE回收率测定

表4　藻油样品中DHA-EE含量

编号NumberGC质量分数Content/%保留时间Retentiontime/minHPLC质量分数Content/%保留时间Retentiontime/min155.8560.0754.4510.55255.8560.0654.5810.52355.5560.1154.5210.61平均Average55.6060.0854.5210.54

3　讨论

目前，对DHA-EE含量的分析主要采用气相色谱法进行测定。根据相关文献报道，气相色谱法存在一定的技术问题，如长链碳的脂肪不易气化、保留时间长[9]。此外，采用气相色谱法对DHA-EE含量进行测定，测定结果显示，DHA-EE线性回归方程y=1 503x-26.275，相关系数R2=0.999 1，在14.52～746.00 ng范围内呈现良好线性关系。但气相色谱法一般采用分流进样，要获得较好的峰形，需设置较大的分流比，同时还要相应增加样品溶液的浓度。本文中，采用高效液相色谱法对海洋微藻油中DHA-EE含量测定，建立DHA-EE回归方程为y=39.91x+765.11(R2=0.008 1)，其在0.008 1～1.92 μg范围内呈良好线性关系，且对藻油中DHA-EE与DPA-EE分离效果良好，相比气相色谱法更为快速、简便可行。

4　结论

本文以藻油中乙酯型DHA为分析对象，建立了基于HPLC的藻油中DHA-EE分离检测方法。结果显示，当采用ZORBAX SB-C8色谱柱，流动相以V(甲醇)∶V(水)=90∶10，流速为1.0 mL/min，检测波长为204 nm，柱温为30 ℃和进样量为10 μL时，DHA-EE在0.008 1～1.92 μg范围内呈现良好线性关系，测定平均回收率为102.42%(n=5，RSD=2.25%)，精密度良好(n=10，RSD=0.32%)，DHA-EE最低定量限可达8.05 ng。建立的DHA-EE分析方法，表现出较好的精密度及稳定性，其待测样品耗量少且成本较低，可用于藻油及其制品中DHA-EE含量的测定，该方法也可以应用于目前乙酯型DHA产品的定量检测。