牛白藤叶中绣球酚的分离及含量测定

袁振海　刘燕　尚立霞　王虹艳

摘要：目的 对牛白藤叶中的绣球酚进行分离鉴定并建立其含量测定方法，为牛白藤药材的进一步开发研究提供参考，同时对不同产地、不同批次牛白藤叶中绣球酚的含量进行比较。方法 采用HPLC，使用Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈∶0.02 mol/L磷酸二氢铵（用磷酸调节pH值至3.0）=33∶67，流速1.0 mL/min，柱温35 ℃，检测波长350 nm。结果 绣球酚在0.412～10.300 μg范围内线性关系良好（r=1.000 0）；平均回收率为99.09%（RSD=0.53%）；精密度及重复性均良好，RSD均小于1%。不同产地及批次牛白藤叶中绣球酚含量为0.03%～0.38%，其中广西产含量最高。结论 本研究建立的方法操作简便、准确，专属性强，重复性好，可用于牛白藤叶中绣球酚的含量测定；不同产地、不同批次牛白藤叶中绣球酚含量差异较大，其中广西、广东产牛白藤中绣球酚含量较高。

关键词：牛白藤；绣球酚；含量测定

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.03.021

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）03-0094-04

Abstract： Objective To conduct isolation identification of hydrangenol and establish a method for content determination of hydrangenol in the leaves of Hedyotis hedyotidea （DC） Merr； To provide references for further development and research of Hedyotis hedyotidea； To compare the contents of hydrangenol in the leaves of Hedyotis hedyotidea of different production areas and different batches. Methods Hydrangenol showed a good linear relationship within the range of 0.412–10.300 μg （r=1.000 0）， with the average recovery of 99.09% （RSD=0.53%）. Good precision and repeatability were achieved with the RSDs smaller than 1.0%. The content range was 0.03%–0.38% for hydrangenol in the leaves of Hedyotis hedyotidea of different production areas and different batches， and the highest contents appeared in those from Guangxi. Conclusion The method is simple， accurate， specific， reproducible and can be used for the content determination of hydrangenol in the leaves of Hedyotis hedyotidea； the contents of hydrangenol in the leaves of Hedyotis hedyotidea of different production areas and different batches are different， and contents in samples from Guangxi and Guangdong are higher.

Keywords： Hedyotis hedyotidea （DC） Merr； hydrangenol； content determination

牛白藤为茜草科耳草属植物牛白藤Hedyotis hedyotidea（DC）Merr的干燥藤茎，又名牛奶藤、土加藤、甜茶，为两广地区民间习用中草药。其味微甘，性凉，归脾、肝经，功效清热解毒、祛风活络、消肿止痛，用于感冒发热、肢体筋骨酸痛、风湿痹痛、跌打损伤。叶可清热解暑，用于感冒风热咳嗽、湿热泄泻[1]。

近年文献报道，从牛白藤的干燥藤茎中分离得到吐叶醇、桦木酮酸、白桦脂酸、白桦醇、表白桦脂酸、乌苏酸等[2]多种化合物，从干燥茎叶中分离得到莨菪亭、羽扇豆醇、表白桦脂酸、熊果酸、齐墩果酸和咖啡酸[3]等化合物，并分别对其抗炎活性及免疫抑制活性进行了研究[4-5]，但关于牛白藤叶中化学成分的含量测定方法目前鲜有报道，且亦未发现有从牛白藤叶中分离出绣球酚的相关报道。笔者从牛白藤干燥叶中分离得到绣球酚，由于该化合物具有降糖、抑菌和抗过敏活性[6]，进一步建立了测定牛白藤叶中绣球酚含量的HPLC方法，旨在为牛白藤叶的进一步开发研究提供参考。

1 仪器与试药

Bruker Avance 600M超导核磁共振仪，瑞士Bruker Corporation；Applied Biosystems API 4000 EI/ESI质谱仪，美国Life Technologies；Buchi C-605中壓泵系统，瑞士Buchi公司；Waters高效液相色谱仪（Waters 600E泵，Waters 2996PDA检测器，Waters四元在线脱气机，Waters717plus自动进样器，Empower色谱工作站），美国Waters公司；AT261电子分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；KQ2200D型数控超声波清洗器，郑州南北仪器设备有限公司。

牛白藤叶购自亳州中药材市场，经山东省中医药研究院林惠彬研究员鉴定为牛白藤Hedyotis hedyotidea （DC）Merr的干燥叶。绣球酚对照品（纯度99.2%），上海宝曼生物科技有限公司；乙腈（色谱纯），超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 绣球酚的分离与鉴定

2.1.1 提取与分离

取牛白藤干燥叶500 g粉碎成粗粉，加水提取2次，合并提取液，减压浓缩至密度为1.14（60 ℃），加乙醇使醇浓度达到60%，0～2 ℃冷藏24 h，过滤，滤液减压浓缩得浸膏；将浸膏用甲醇溶解，加入硅胶拌样，干燥后进行柱层析分离。经石油醚-乙酸乙酯系统进行梯度洗脱，在薄層色谱参考下合并洗脱液，其中石油醚-乙酸乙酯（89∶11～87∶13）段经乙醇反复重结晶得化合物Ⅰ（白色晶体，1.0 g）。

2.1.2 结构鉴定

化合物Ⅰ：白色晶体，mp.179～181 ℃；1HNMR（DMSO-d6，600 MHz）δ：3.14（1H，dd，J=2.4，16.8 Hz，H-4a），3.51（1H，brd，J=16.8Hz，H-4b），5.67（1H，brd，J=2.4 Hz，H-3），6.81（2H，d，J=8.4 Hz，H-3'，5'），6.88（1H，d，J=7.2 Hz，H-5），6.90（1H，d，J=7.2 Hz，H-7），7.34（2H，d，J=8.4 Hz，H-2'，6'），7.53（1H，dd，J=7.2，7.2Hz，H-6），9.65（1H，s，OH），10.93（1H，s，OH）；13CNMR（DMSO-d6，150 MHz）δ：33.9（C-4），80.9（C-3），108.9（C-8a），115.6（C-3'，5'），115.9（C-7），118.8（C-5），128.7（C-2'，6'），128.9（C-1'），136.8（C-6），141.1（C-4a），158.2（C-4'），161.4（C-8），169.8（C-1）；ESI-MSm/z 257[M+1]+，274[M+NH4]+。综合上述信息与文献报道[6-7]，确定化合物Ⅰ为绣球酚。

2.2 绣球酚的含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Zorbax Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈∶0.02 mol/L磷酸二氢铵（用磷酸调节pH值至3.0）=33∶67；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：350 nm；进样量：10 μL。

2.2.2 样品预处理

取1001批药材粉末（过2号筛）约1.5 g，精密称定，置圆底烧瓶中，分别精密加入25 mL甲醇、乙醇、70%乙醇、水，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定。结果甲醇、乙醇作为溶剂提取的绣球酚含量较高，测定结果差异不大，综合考虑其他因素，选择乙醇作为提取溶剂。

取1001批药材粉末（过2号筛）4份，每份约1.5 g，精密称定，置圆底烧瓶中，分别精密加入乙醇25 mL，称定质量，2份加热回流1 h，2份超声处理（100 W，50 Hz）30 min，分别放冷，再称定质量，用乙醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定。结果回流提取所得绣球酚含量较高，因此选择回流提取。

取1001批药材粉末（过2号筛）约1.5 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入乙醇25 mL，分别加热回流0.5、1、2 h，放冷，再称定质量，用乙醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定。结果回流1 h测得的绣球酚含量明显高于0.5 h，2 h与1 h无明显差异，因此选择回流时间为1 h。

提取溶剂、提取方法、回流时间考察结果见表1。

2.2.3 溶液的制备

2.2.3.1 对照品溶液的制备

取绣球酚对照品适量，精密称定，加乙醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，摇匀，即得。

2.2.3.2 供试品溶液的制备

取药材粉末（过2号筛）约1.5 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入乙醇25 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用乙醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.2.4 专属性试验

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，见图1。供试品溶液的色谱图中，在与对照品溶液的色谱图相应的位置上有相同保留时间的色谱峰。

2.2.5 线性关系考察

取绣球酚对照品适量，精密称定，加乙醇制成每1 mL含1 mg的对照品溶液，作为对照品贮备液，分别精密吸取对照品贮备液适量，加乙醇配制成不同浓度的对照品溶液。精密吸取上述不同浓度对照品溶液各10 ?L（分别含绣球酚0.412、0.824、1.648、2.060、3.090、4.120、10.300 ?g）注入液相色谱仪，以峰面积为纵坐标、对照品含量（?g）为横坐标进行线性回归，得回归方程Y=1 034 893.9X-34 011.6，r=1.000 0。结果表明绣球酚在0.412～10.300 μg范围内与峰面积呈现良好的线性关系。

2.2.6 精密度试验

取“2.2.5”项下浓度为0.206 0 mg/mL的对照品溶液，连续进样6次，每次10 ?L，测得峰面积RSD=0.21%，表明精密度良好。

2.2.7 稳定性试验

取按“2.2.3”项下方法制备的对照品和供试品溶液，分别于配制后室温放置0、1、2、4、8、12、24 h时精密吸取10 ?L，注入液相色谱仪进行测定，测得绣球酚对照品及供试品溶液峰面积的RSD分别为0.34%、0.53%。结果表明，对照品及供试品溶液在室温条件下24 h内稳定。

2.2.8 重复性试验

取样品（批号1101）粉末6份，精密称定，按“2.2.3.2”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取10 ?L注入液相色谱仪测定，测得绣球酚平均含量为0.36%，RSD=1.01%。表明本法具有良好的重复性。

2.2.9 加样回收率试验

取已知含量的样品（批号1101）细粉9份，各约0.75 g，精密称定，分为3组，每组3份，按已知含量的80%、100%、120%分别加入2.70 mg/mL绣球酚对照品溶液0.8、1、1.2 mL，再按“2.2.3.2”项下方法制备成供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，结果绣球酚平均回收率为99.09%，RSD=0.53%，见表2。

2.3 样品含量测定

取不同产地、不同批次样品，分别粉碎，过2号筛，按“2.2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项色谱条件测定，计算绣球酚含量，结果见表3。

3 讨论

研究表明，绣球酚在四氧嘧啶致小鼠糖尿病模型试验中表现出良好的抗糖尿病活性，且KK-Ay小鼠服用绣球酚200 mg/（kg·d）后，2周内血糖和游离脂肪酸水平明显降低[8]；此外，还有良好的抗菌和抗过敏作用[9]。但目前尚未见采用HPLC测定药材中绣球酚含量的相关研究报道，因此，本研究建立了牛白藤叶中绣球酚的HPLC含量测定方法。

本试验分别比较了4种不同提取溶剂、超声和加热回流2种提取方法，并在此基础上对回流提取时间进行了考察，最终确定采用乙醇加热回流提取1 h的方法可将牛白藤叶中绣球酚提取完全，且该方法简便、合理、可操作性强。

本研究结果显示，广西产牛白藤叶中绣球酚平均含量约为0.3%，广东产者含量约为0.27%，而云南、贵州产者含量较低，说明不同产地、不同批次牛白藤叶中绣球酚的含量差异较大，该结果可为牛白藤药材质量标准的制定以及制剂研究提供依据。此外，广东省中药材标准中收录牛白藤全年可采，本研究未对不同采摘季节牛白藤叶的绣球酚含量进行研究，因此，尚不能确定其叶中的绣球酚含量差异是否与采摘季节具有相关性，有必要对其进一步研究，以便更好地确定其采摘季节及原料产地，为牛白藤叶的开发研究提供依据。

本研究建立的牛白藤中绣球酚的HPLC含量测定方法操作简便、灵敏、准确、专属性强、重复性好，可为绣球酚的含量测定研究提供参考。

参考文献：

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[2] 张甜甜，高莎莎，侯俊杰，等.牛白藤的化学成分及其免疫抑制活性研究[J].中国中药杂志，2015，40（12）：2357-2362.

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[4] 沈守仁，陈少峰.高效液相色谱法测定牛白藤中齐墩果酸和熊果酸含量[J].现代医药卫生，2012，28（20）：3067-3068.

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[6] 杨大坚，钟炽昌，刘红亚.绣球花化学成分研究[J].中国中药杂志， 1994，19（5）：293-295.

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[8] ZHANG H， MATSUDA H， KUMAHARA A， et al. New type of anti-diabetic compounds from the processed leaves of Hydrangea macrophylla var. thunbergii （Hydrangeae Dulcis Folium）[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，2007，17：4972-4976.

[9] KAKEGAWA H， MATSUMOTO H， SATOH T. Inhibitory Effects of hydrangenol derivatives on the activation of hyaluronidase and their antiallergic activities[J]. Planta Medica，1988，16：385-389.

（收稿日期：2017-09-26）

（修回日期：2017-10-18；编辑：陈静）