野黄芩苷对血管紧张素Ⅱ诱导的新生大鼠心肌成纤维细胞的增殖及ERK1/2、p38 MAPK信号通路的影响

辛博 陈力 万丽丽 郭澄

中圖分类号 R96；R932 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）05-0629-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.05.13

摘 要 目的：研究野黄芩苷对血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）诱导的新生大鼠心肌成纤维细胞（CFs）的增殖及细胞外调节蛋白激酶（ERK1/2）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）信号通路的影响。方法：体外分离培养新生大鼠CFs，将细胞分为空白组（空白培养基）、Ang Ⅱ组（10-7 μmol/L）、50 μmol/L 野黄芩苷组和Ang Ⅱ（10-7 μmol/L）+5、10、20、50 μmol/L 野黄芩苷组，培养48 h后，采用CCK-8法检测细胞增殖能力。另取细胞分为空白组（空白培养基）、Ang Ⅱ组（10-7 μmol/L）和Ang Ⅱ（10-7 μmol/L）+5、10、20、50 μmol/L 野黄芩苷组，培养48 h后，检测细胞中Ⅰ型胶原（ColⅠ）、Col Ⅲ、α-平滑肌肌蛋白（α-SMA） mRNA 表达和细胞培养液中羟脯氨酸（HYP）含量，以及细胞中ERK1/2、p38 MAPK磷酸化水平。结果：5、10、20、50 μmol/L 的野黄芩苷均能显著抑制Ang Ⅱ诱导的CFs的增殖（P<0.05），显著下调Ang Ⅱ刺激的CFs中ColⅠ、Col Ⅲ和α-SMA mRNA的表达（P<0.05），显著抑制Ang Ⅱ刺激后细胞培养液中HYP含量的增加和细胞中ERK1/2、p38 MAPK的磷酸化（P<0. 05），且具有一定的浓度依赖性。结论：野黄芩苷对Ang Ⅱ诱导的CFs的增殖具有一定的抑制作用，其机制可能与抑制ERK1/2、p38 MAPK的磷酸化有关。

关键词 野黄芩苷；大鼠心肌成纤维细胞；增殖；细胞外调节蛋白激酶；p38丝裂原活化蛋白激酶

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of scutellarin on the proliferation of cardiac fibroblasts （CFs） in neonate rats induced by angiotensin Ⅱ （ANGⅡ） and signal pathway of extracellular regulated protein kinase （ERK1/2） and p38 mitogen activated protein kinase （p38 MAPK）. METHODS： CFs of neonatal rat were isolated and cultured in vitro， and then divided into blank group （blank culture medium）， Ang Ⅱ group （10-7 μmol/L），50 μmol/L scutellarin group and Ang Ⅱ（10-7 μmol/L）+5， 10， 20， 50 μmol/L scutellarin groups. After cultured for 48 h， CCK-8 assay was used to detect the proliferation ability of cells. Other cells were selected and divided into blank group （blank culture medium）， Ang Ⅱ group （10-7 μmol/L） and Ang Ⅱ+5， 10， 20， 50 μmol/L scutellarin groups. After cultured for 48 h， mRNA expression of ColⅠ， Col Ⅲ and α-SMA in cells and hydroxyproline （HYP） content in cell culture fluid were detected； phosphorylation levels of ERK1/2 and p38 MAPK in cells were also detected. RESULTS： 5， 10， 20， 50 μmol/L scutellarin could significantly inhibit the proliferation of CFs induced by Ang Ⅱ （P<0.05）， and decreased mRNA expression of ColⅠ， Col Ⅲ and α-SMA in CFs induced Ang Ⅱ （P<0.05）. 5， 10， 20， 50 μmol/L scutellarin could significantly inhibit the increase of HYP content and the phosphorylation of ERK1/2 and p38 MAPK after induced by Ang Ⅱ （P<0.05）， in dose-dependent manner. CONCLUSIONS： Scutellarin inhibits the proliferation of CFs induced by Ang Ⅱ， the mechanism of which may be associated with reduction of ERK1/2 and p38 MAPK phosphorylation.

KEYWORDS Scutellarin； Cardiac fibroblasts of rats； Proliferation； Extracellular regulated protein kinase； p38 mitogen activated protein kinase

心肌纤维化是指正常心肌组织中心肌成纤维细胞（Cardiac fibroblasts，CFs）过度增殖，细胞外基质过量沉积的病理生理过程[1-3]，会导致心脏收舒功能紊乱，心室顺应性下降，最终导致心力衰竭，而心力衰竭是多种心脏疾病终末期的表现[4]。因此，防治或逆转心肌纤维化的临床意义重大。CFs占心肌组织中细胞总数的90%以上[5]，在细胞因子、炎症因子、多肽、激素等外界刺激下产生细胞外基质，在心肌纤维化过程中发挥关键作用。细胞外调节蛋白激酶（ERK1/2）和p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）通路是MAPK通路的主要组成部分。研究显示，调控ERK1/2和p38 MAPK通路可抑制CFs的增殖、细胞外基质分泌和心肌纤维化的发展[6-7]。

野黄芩苷（Scutellarin，SCU）是从菊科植物短茎飞蓬Erigeron breviscapus （Vant.）Hand-Mazz的干燥全草中提取出的一种黄酮类单体。研究表明，SCU对心血管疾病有显著的药理作用，包括舒张血管、保护缺血再灌注损伤、抗心脏重塑、抗心律失常等，SCU在临床上对心肌梗死患者心脏具有显著保护作用[8]，而CFs的增殖是心肌梗死的主要病理表现之一。本文旨在探讨SCU对原代大鼠CFs体外增殖及细胞外基质表达的影响，并从ERK1/2和p38 MAPK 通路入手探讨其可能的机制。

1 材料

1.1 儀器

Ⅸ 71型荧光相差倒置显微镜（日本Olympus 公司）；聚合酶链式反应（PCR）仪（美国Applied Biosystems 公司）；Odyssey红外荧光扫描成像系统（美国LI- COR公司）；Epoch型酶标仪（美国BioTek公司）。

1.2 药品与试剂

野黄芩苷对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-16030406，纯度：>98%）；血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ，美国Sigma公司，批号：SLBH9339V，纯度：>98%）；CCK-8细胞增殖检测试剂盒（日本同仁化学研究所）；二甲基亚砜（DMSO，索莱宝生物科技有限公司）；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；羟脯氨酸（HYP）含量测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：A030-1）；反转录试剂盒和PCR扩增试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司，批号：R223-01、Q341-02）；小鼠抗ERK1/2、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）、p38 MAPK、磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）抗体和兔抗波形蛋白（Vimentin）抗体（美国Santa Cruz 公司）；鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（杭州华安生物有限公司）；IRDyeTM 800羊抗小鼠荧光二抗（美国LI-COR 公司）；Alexa Fluor 546驴抗兔荧光二抗（上海翊圣生物科技有限公司）；Ⅰ型胶原（Col Ⅰ）、Col Ⅲ、α-平滑肌肌蛋白（α-SMA）引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 动物

新生（2日龄）SD大鼠购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物质量合格证号：SCXK（沪） 2013-0016。

2 方法

2.1 溶液的制备

（1）SCU溶液：称取SCU对照品4.623 mg， 溶解于100 μL DMSO中，制成浓度为10-1 mol/L的母液。试验时将母液用培养基稀释到各所需浓度，现配现用。（2）Ang Ⅱ溶液：称取5 mg Ang Ⅱ，溶解于480 μL高压灭菌纯水中，得到浓度为10-2 mol/L的母液，分装，-80 ℃保存。临用时用培养基稀释到所需浓度。

2.2 原代大鼠CFs的分离培养

将新生大鼠置于75%乙醇中浸泡1 min，转移至超净台，处死后无菌器械取出其心脏，用含双抗的预冷磷酸盐缓冲液（PBS）清洗 3 次，剪碎。组织碎块加入10倍体积的0.05%胰蛋白酶37 ℃消化3 min，吸弃上层液体；加入6 倍体积的0.08%胰蛋白酶消化液37 ℃消化3 min后，吸取细胞悬液放入离心管中，加入等体积的含10%胎牛血清（FBS）的高糖细胞培养基（HG/DMEM）终止消化，收获细胞；重复消化 4～5 次，所得细胞悬液 以13 225×g离心 5 min，弃上清，细胞沉淀加入含10%FBS的 HG/DMEM 10 mL，吹打均匀后放入10 cm培养皿中，恒温培养箱中放置 90 min 后，最先贴壁的细胞为CFs（采用免疫荧光检测细胞Vimentin抗体表达[9]，结果细胞纯度大于98%）。吸弃含有杂质细胞的培养基， PBS清洗2次，加入含10% FBS的HG/DMEM 10 mL，继续培养CFs；以后每 2 d 换液 1 次，待 CFs 铺满培养皿底部80%时按1 ∶ 3进行传代，用2～3代细胞进行后续试验。

2.3 细胞存活率检测

将2～3代CFs接种于96孔板中，每孔3 000个，待细胞贴壁后，加入无血清DMEM培养基饥饿处理24 h。将细胞分为空白组、Ang Ⅱ组（10-7 μmol/L）、SCU组（50 μmol/L）和Ang Ⅱ（10-7 μmol/L）+5、10、20、50 μmol/L SCU组，并另设未加细胞的阴性对照组，分别于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养48 h。试验结束前2 h更换新鲜培养基，并在每孔中加入10 μL CCK-8试剂，2 h后于酶标仪490 nm波长处测定各孔的光密度（OD）值，计算细胞存活率[细胞存活率（%）=（给药组OD值-空白组OD值）/（空白组OD值-阴性对照组OD值）×100%]。试验重复3次，每组设置6个复孔。

2.4 细胞中ColⅠ、Col Ⅲ和α-SMA mRNA表达水平检测

将2～3代的CFs接种于6孔板中，待细胞贴壁长至70%密度时，更换为不含血清的DMEM培养基饥饿处理24 h。然后将细胞分为空白组（空白培养基）、Ang Ⅱ组（10-7 μmol/L）和Ang Ⅱ（10-7 μmol/L）+5、10、20、50 μmol/L SCU组（Ang Ⅱ 和SCU 同时给药），37 ℃、5%CO2恒温培养箱中继续培养48 h后，按照试剂盒说明书操作提取RNA，采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法测定各组细胞中Col Ⅰ、Col Ⅲ、α-SMA mRNA表达水平。引物：GAPDH上游序列引物序列为5′ -TGATTCTAC- CCACGGCAAGTT-3′ ，下游引物序列为 5′ -TGATGGG- TTTCCCATTGATGA-3′ ，扩增产物片段长度为1 621 bp；ColⅠ上游引物序列为5′ -ACGTCCTGGTGAAGTTGGTC-3′ ，下游引物序列为5′ -TCCAGCAATACCCTGAGGTC-3′ ，扩增产物片段长度为5 843 bp；Col Ⅲ上游引物序列为5′ -AGGCCAATGGCAATGTAAAG-3′ ，下游引物序列为5′ -TATTGGTGGGTGAAACAGCA-3′ ，扩增产物片段长度为4 538 bp；α-SMA上游引物序列为5′ -ATGACATGACTGAAGCA-3′ ，下游引物序列为5′ -TTCTCTGTGGAGCTGAAGCA-3′ ，扩增产物片段长度为13 315 bp。反应体系（10 μL）：SYBR缓冲液5 μL，上、下游引物各0.2 μL，cDNA 1 μL，双蒸水3.6 μL。反应条件：94 ℃、30 s；95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，共进行 40 个循环后进行溶解曲线的检测。采用2-ΔΔct计算目的基因mRNA的表达水平，其中ct值表示每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环次数。

2.5 细胞培养液中HYP含量检测

将2～3代CFs接种于6孔板中，待细胞贴壁长至70%密度时，更换为不含血清的DMEM培养基饥饿处理24 h，然后按“2.4”项下方法分组、加药，将细胞置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中继续培养48 h后，移液器取细胞培养液500 μL，按照试剂盒说明书操作检测细胞培养液中HYP含量。

2.6 细胞中ERK1/2、p38 MAPK、p-ERK1/2、p-p38 MAPK蛋白表达水平测定

取细胞按“2.5”项下方法分组，加入相应浓度SCU处理细胞2 h后，加入Ang Ⅱ处理20 min，然后加入适量的蛋白裂解液冰上裂解细胞，提取总蛋白和磷酸化蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法进行蛋白定量。取总蛋白依次经聚丙烯酰氨凝胶电泳、转膜、封闭等步骤后，加入ERK1/2（1 ∶ 1 000）、p-ERK1/2（1 ∶ 1 000）、p38 MAPK（1 ∶ 1 000）、p-p38 MAPK（1 ∶ 1 000）和GAPDH（1 ∶ 5 000）一抗，4 ℃孵育过夜，然后加入荧光二抗（1 ∶ 5 000），室温孵育1 h。红外荧光扫描成像系统扫描印迹，对各组条带进行灰度分析，将目的蛋白灰度值和内参（GAPDH）灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。

2.7 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。数据以x±s表示，采用单因素方差分析和LSD 检验进行组间比较。P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 CFs细胞存活率检测结果

与空白组比较，Ang Ⅱ组细胞呈明显增殖状态，细胞存活率显著升高（P<0.05）； SCU组（50 μmol/L）细胞的增殖活力未受到影响，细胞存活率差异无统计学意义（P>0.05）。与Ang Ⅱ组比较，Ang Ⅱ+5、10、20、50 μmol/L SCU组细胞的增殖受到明显抑制，且具有一定的浓度依赖性，细胞存活率均显著降低（P<0.05）。结果提示，SCU在正常情况下对CFs增殖无影响，但可抑制Ang Ⅱ诱导的细胞过度增殖，结果见图1。

3.2 细胞中ColⅠ、Col Ⅲ、α-SMA mRNA表达水平检测结果

与空白组比较，Ang Ⅱ组细胞中ColⅠ、Col Ⅲ、α-SMA 的mRNA表达水平均显著升高（P<0.05）。与Ang Ⅱ组比较，Ang Ⅱ+5、10、20、50 μmol/L组细胞中ColⅠ、α-SMA、Col Ⅲ mRNA表达水平均不同程度降低，除Ang Ⅱ+5 μmol/L SCU组细胞中ColⅠ、α-SMA mRNA表达水平降低不显著外，其余各组指标差异均有统计学意义（P<0.05），结果见表1。

3.3 细胞培养液中HYP含量检测结果

与空白组比较，Ang Ⅱ组细胞培养液中HYP含量显著升高（P<0.05）。与Ang Ⅱ组比较，Ang Ⅱ+5、10、20、50 μmol/L SCU组细胞培养液中HYP含量显著降低（P<0.05），且具有一定的浓度依赖性。空白组、Ang Ⅱ组和Ang Ⅱ+5、10、20、50 μmol/L SCU组细胞培养液中HYP含量依次为（13.69±0.397）、（17.62±0.975）、（14.45±0.375）、（13.45±0.467）、（12.95±0.0521）、（11.22±0.352） μg/mL。

3.4 细胞中ERK1/2、p-ERK1/2、p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白表达水平检测结果

与空白组比较，Ang Ⅱ组细胞中p-ERK1/2、p-p38 MAPK蛋白表达水平显著升高（P<0.01）。与Ang Ⅱ组比较，各给药组细胞中p-ERK1/2、p-p38 MAPK蛋白表达水平均显著降低（P<0.01），电泳图见图3，测定结果见表2。

4 讨论

研究表明，CFs在促纤维化因子，如炎症因子、血管活性肽、激素等刺激下，会发生增殖、迁移和分泌细胞外基质等一系列生理过程[5]。而CFs的过度增殖和细胞外基质沉积是心肌纤维化发生发展的主要原因。因此，本研究探讨了SCU对Ang Ⅱ刺激的CFs增殖和细胞外基质表达的影响。结果显示，SCU能抑制Ang Ⅱ刺激的CFs增殖，降低细胞中Col Ⅰ、Col Ⅱ、α-SMA mRNA的表达以及细胞培养液中HYP含量，并具有一定的浓度依赖性，提示SCU可通过抑制CFs的增殖而达到抗心肌纤维化的目的。

ERK1/2和p38 MAPK是MAPK家族中的主要成员，参与调控细胞的生长、增殖、分化和炎症应答等多种重要病理生理过程。有研究显示，ERK1/2、p38 MAPK通路与心肌纤维化和CFs的增殖密切相关[10-12]。有报道证实，ERK1/2和p38 MAPK抑制剂可有效抑制心肌梗死造成的小鼠心肌纤维化的发生发展[13]。此外，ERK1/2及p38 MAPK通路同时参与了CFs向肌成纤维细胞转化的过程，刺激胶原的分泌，调控心肌纤维化的发生[14]。本研究结果显示，在Ang Ⅱ刺激下，CFs中ERK1/2和p38 MAPK被激活，磷酸化水平升高，而SCU能够抑制由Ang Ⅱ诱导的ERK1/2和p38 MAPK的激活，從而抑制CFs的增殖和细胞外基质表达，发挥其抗心肌纤维化的作用。

近年来，越来越多的基础研究提示，中医药对心肌纤维化具有良好的防治作用。SCU是灯盏细辛注射液的主要有效成分，该注射液常用来治疗冠心病、心绞痛等疾病。SCU可有效抑制异丙肾上腺素诱导的心肌细胞上皮细胞间质转化（EMT）过程[15]。本研究表明，SCU可有效抑制Ang Ⅱ 诱导的CFs的增殖和细胞外基质的表达，其机制可能与抑制ERK1/2和p38 MAPK通路的激活相关，该结论为抗心肌纤维化新药的研发提供了参考。

参考文献

[ 1 ] SEGURA AM， FRAZIER OH， BUJA LM. Fibrosis and heart failure[J]. Heart Fail Rev，2014，19（2）：173-185.

[ 2 ] FAN D. Cardiac fibroblasts， fibrosis and extracellular matrix remodeling in heart disease[J]. Fibrogenesis Tissue Repair，2012，5（1）：15-28.

[ 3 ] KONG P， CRISTIA P， FRANGOGIANNIS NG. The pa- thogenesis of cardiac fibrosis[J]. Cell Mol Life Sci， 2014，71（4）：549-574.

[ 4 ] 宋秉春，张金国.心肌纤维化发病机制及治疗进展[J].济宁医学院学报，2015，5（1）：65-67.

[ 5 ] PORTER KE， TURNER NA. Cardiac fibroblasts：at the heart of myocardial remodeling[J]. Pharmacol Ther， 2009，123（2）：255-278.

[ 6 ] HU J，WANG X，WEI SM，et al. Activin A stimulates the proliferation and differentiation of cardiac fibroblasts via the ERK1/2 and p38-MAPK pathways[J]. Eur J Pharmacol，2016，15（789）：319-327.

[ 7 ] XU Y，XIAO H，CHEN Y，et al. Inhibitory effects of oxymatrine on TGF-β1-induced proliferation and abnormal differentiation in rat cardiac fibroblasts via the p38MAPK and ERK1/2 signaling pathways[J]. Mol Med Rep，2017，16（4）：5354-5362.

[ 8 ] GAO JL， CHEN G， HE HQ， et al. Therapeutic effects of breviscapine in cardiovascular diseases： a review[J]. Front Pharmacol，2017，23（8）：289-302.

[ 9 ] 范海. PDGFR-β/PI3K/AKT信号通路在PDGF-BB诱导大鼠心肌成纤维细胞所致心肌纤维化中的作用[D].合肥：安徽医科大学，2015.

[10] MUSLIN AJ. MAPK signaling in cardiovascular health and disease： molecular mechanisms and therapeutic targets[J]. Clin Sci （Lond），2008，115（7）：203-218.

[11] STOCKAND JD， MESZAROS JG. Aldosterone stimulates proliferation of cardiac fibroblasts by activating KiRasA and MAPK signaling[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，284（1）：H176-H184.

[12] MACLEAN J， PASUMARTHI KB. Signaling mechanis- ms regulating fibroblast activation， phenoconversion and fibrosis in the heart[J]. Indian J Biochem Biophys，2014，51（6）：476-482.

[13] YEH CC， LI H， MALHOTRA D， et al. Distinctive ERK and p38 signaling in remote and infarcted myocardium during post-MI remodeling in the mouse[J]. J Cell Biochem，2010，109（6）：1185-1191.

[14] BIERNACKA A， DOBACZEWSKI M， FRANGOGIA- NNIS NG. TGF?β signaling in fibrosis[J]. Growth Factors，2011，29（5）：196-202.

[15] ZHOU H， CHEN X， CHEN LZ， et al. Anti-fibrosis effect of scutellarin via inhibition of endothelial-mesenchymal transition on isoprenaline-induced myocardial fibrosis in rats[J]. Molecules，2014，19（10）：15611-15623.

（收稿日期：2017-08-08 修回日期：2017-12-01）

（編辑：林 静）