高频超声心动图评价IGFBP-4转基因小鼠心肌梗死后心脏功能的变化

张宇辉， 刘　怡， 夏良华， 陈　明， 金佳美， 沃　达

(1. 同济大学附属东方医院医学超声科，上海　200120; 2. 同济大学附属东方医院转化医学平台，上海　200120)

胰岛素样生长因子结合蛋白-4(insulin-like growth factor binding protein-4, IGFBP-4)作为一种全新的分泌型心肌细胞分化诱导因子,可以通过调控Wnt信号通路而参与心脏细胞的损伤修复过程[1]，从而阻止心肌梗死后心肌细胞DNA损伤的发生,起到干预心肌梗死患者预后的作用。准确评价IGFBP-4转基因小鼠心肌梗死前后心功能的变化对于确定IGFBP-4诱导心肌细胞分化再生功能至关重要。近年来，小动物高频超声(high frequency ultrasound, HFUS)无创成像技术不断发展，它通过中心频率10MHz 以上的超声对各种动物模型进行成像检测，在观察胚胎发育、组织疾病、肿瘤浸润等基础研究中都起到了不可或缺的作用[2-4]。本研究通过IGFBP-4转基因小鼠建立心肌梗死动物模型，使用高频超声心动图评价心肌梗死前后小鼠模型心功能变化，并与正常小鼠心功能变化作比较，旨在确定高频超声心动图在干预心肌梗死IGFBP-4转基因小鼠预后中的作用。

1　材料与方法

1.1　实验动物与模型建立

1.1.1实验动物ICR雄性小鼠(上海斯莱克实验动物有限公司)及构建成功的IGFBP-4/H74P点突变体在心脏特异表达的转基因小鼠(同济大学附属东方医院转化平台)各30只，体质量20～25g，清洁级，分为对照组(n=30)和IGFBP-4转基因组(n=30)。于同济大学SPF动物中心按标准动物管理条例饲养,所有动物操作都符合伦理组织的要求。

1.1.2模型建立无菌手术在同济大学附属东方医院转化平台实验动物室进行。以2%戊巴比妥钠(80mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰卧固定，脱毛备皮，四肢连接心电图，气管插管连接呼吸机。麻醉约15min后，取右侧卧位，距胸骨左缘0.2～0.4cm处沿第四肋间做横行切口，开胸充分暴露心脏，少量游离心包，以左心耳前下角为标志以8-0proline缝线仔细结扎冠状动脉左前降支近段，结扎后发现左心室前壁苍白，对出现心律失常的小鼠及时予以利多卡因处理。经心电图检查确认模型建立成功后关胸复苏，保温过夜。

1.2　主要仪器与方法

1.2.1主要仪器彩色超声诊断仪Vevo 2100购自加拿大VisualSonics公司，探头型号： MS-40012 L，探头频率： 30MHz。倒置式光学显微镜LX70-141购自日本奥林巴斯公司。

1.2.2高频超声心动图检查分别于术前1d及术后1、2周对存活的小鼠进行超声心动图检查，采用双盲法由助手将两组小鼠混合编号进行麻醉及检查。待检测小鼠经异氟烷吸入麻醉，心率在检查过程中保持恒定，观察并控制于(400±20)次/min为宜。使用加热平板以保证小鼠检查过程中体温恒定。为了保证成像效果，保持小鼠固定姿势，脱毛备皮，应用适量的超声耦合剂于胸口皮肤。检查所得值均为取连续5个心动周期的均值。

胸骨旁长轴切面： 将高频探头置于小鼠左胸侧，探头切迹指向小鼠头部，逆时针旋转30°～45°即可，可以清楚显示主动脉根部，左心室，室间隔及二尖瓣等结构，见图1。转换至M型模式，取样线置于二尖瓣腱索水平，垂直于室间隔及左心室后壁，曲线扫描速度为200mm/s，即得心室波群的M型曲线。可测量得到相应数据： 室间隔厚度(interventricular septum diameter, IVSd)，左心室后壁厚度(left ventricle posterior wall diameter, LVPWd)，左心室舒张末期内径(left ventricular internal diameter at end diastolic, LVIDd)，左心室收缩末期内径(left ventricular internal diameter at end systolic, LVIDs)，经系统计算得出左心室射血分数(ejection fraction, EF)、左心室短轴缩短率(fractional shortening, FS)。

图1　胸骨旁长轴切面图Fig.1　Parasternal long axis viewA： 左心室收缩末期内径,B： 左心室舒张末期内径；黄色箭头表示室间隔，绿色箭头表示主动脉，红色箭头表示左心室后壁

胸骨旁短轴切面： 将探头沿长轴切面顺时针旋转90°，切面与左心室长轴相垂直。向下略微移动探头，可以沿长轴从不同的层面观察左心室的横断面(如二尖瓣水平的左心室横断面、乳头肌水平的左心室横断面、心尖水平的左心室横断面)，图像深度调节至7.0～14.0cm，能全面观察心肌运动情况，准确评估心脏的形态，是评价左心室收缩功能的最佳切面，见图2。可测量得到左心室质量(left ventricular mass, LVM)、左心室容积(end-diastolic volume, EDV)及左心室收缩末容积(end-systolic volume, ESV)等数据。

图2　胸骨旁短轴切面图(乳头肌水平)Fig.2　Parasternal short axis view(papillary muscle level)

心尖四腔切面： 将探头置于横切面上，探头切迹面向小鼠左侧，然后将探头轻微移动至胸廓的外侧壁。在该位置上进行微调可得到心尖四腔切面并于该切面测量二尖瓣血流速度。心尖四腔切面是评价收缩功能及左心室舒张功能十分重要的一个切面，见图3。

图3　心尖四腔切面图Fig.3　The apical four chamber viewA为左心室，B为右心室，C为左心房，D为右心房；AC之间为二尖瓣，BD之间为三尖瓣

1.2.3左心室称重术后1周进行超声心动图检测后处死两组存活小鼠，取出心脏后剪取左心室(保留室间隔)，充分拭去左心室表面及腔室内的残留血液及血块，通过电子秤进行称重得到左心室质量LVM实测值，与通过高频超声心动图所得的LVM测量值进行相关性分析以明确高频超声心动图评估心功能的可靠性。

1.2.4病理学检查从称重后的左心室留取小鼠左心室心肌组织，截取左心室中段横切面，4%甲醛固定脱水，石蜡包埋，经H-E染色，光学显微镜下放大200倍，观察拍摄。

1.3　统计学处理

2　结　　果

2.1　术后存活率

对照组及IGFBP-4转基因组小鼠心肌梗死模型2周后死亡率均为10%(3∶30),即2周后2组均剩余27只小鼠。死亡原因分别为室颤、血栓形成、失血性休克及肺部感染等。

2.2　高频超声心动图检查结果

2.2.1冠状动脉左前降支结扎术前后心功能变化手术前2组小鼠体质量、心率、IVSd、LVPWd、LVIDd、LVIDs、EF、FS等差异无统计学意义(P>0.05)。术后1周，2组小鼠心功能与术前相比均有显著下降，表现在室壁变薄，心室腔扩大，EF及FS值下降(P<0.05)；而对照组术后2周心功能较第1周心功能明显降低(P<0.05)，IGFBP-4转基因组术后2周心功能与第1周差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2.2对照组及IGFBP-4组小鼠术后心功能参数比较术后1周，对两组小鼠心功能参数进行比较，室壁厚度、心腔容积及左心室收缩功能均未发现明显差异；术后2周，两组小鼠进行心功能检查，发现各项参数均有差异，IGFBP-4组小鼠室间隔厚度及EF值大于对照组，差异有统计学意义(LVPWd：t=1.799，P=0.041；EF：t=2.004，P=0.024)；而左心室内径及容积则皆小于对照组，差异有统计学意义(均P<0.05)，见表1。

表1　两组小鼠手术前后心脏功能参数比较Tab.1　Comparison of cardiac function parameters between two groups of mice before and after operation

与术前比较，*P<0.05，**P<0.01；与术后第2周比较，#P<0.05，##P<0.01；与对照组比较，ΔP<0.005

2.3　左心室心肌组织病理学检查结果

第2周后处死两组小鼠并尸解，可发现两组小鼠均有心脏增大，部分小鼠有不同程度的血性胸水及心包积液。可见梗死区域变性坏死，心肌纤维断裂破坏，部分形成肌溶灶，心肌间质大部分呈充血水肿，镜下可见大量炎症细胞浸润分布，并可见肉芽组织形成。而IGFBP-4组小鼠存活心肌呈现片状分布，梗死面积明显少于对照组，部分梗死灶周边可见新生血管，炎症细胞浸润程度也略低于对照组，见图4，病理结果与超声心动图心功能检测结果一致。

2.4　两组小鼠2周后LVM高频超声测量值与尸检实测值相关性检验

对照组及IGFBP-4组小鼠LVM高频超声测量值与尸检实测值相关性较好，两组相关系数r值别为0.89与0.93(均P<0.001)，见表2。

表2　两组LVM高频超声测量值与尸检实测值相关性

3　讨　　论

心肌梗死导致心肌细胞DNA损伤发生在心肌梗死后1h，而在心肌梗死12h后DNA损伤最严重；与此相反的是心肌细胞核内β-catenin的数量在心肌梗死后30min内迅速上升，然后在心肌梗死后2h左右回落至基础状态。前期研究[1，5]发现，IGFBP-4能够明显抑制细胞核内β-catenin的表达，推测IGFBP-4可能会阻止心肌细胞DNA损伤的发生。

本研究是通过建立IGFBP-4转基因小鼠与ICR小鼠的心肌梗死模型来比较两组之间心功能差异的，故对心脏功能参数的准确评估至关重要。虽然心导管技术是评估心功能的最准确检查，但有创检查这一点使其运用于动物实验中受到限制，而小动物高频超声能够通过高频探头准确地观察心脏的心态运动以及进行功能评估，操作简便，费用低廉，对于实验动物数量多、模型病死率高的动物实验是最佳的选择。在本研究中，虽然小鼠心脏体积较小且心率快都增加了形态学观察及心功能评估的难度，但采用30MHz的高频探头仍可以清楚显示心内结构及血流，主要通过胸骨旁长轴、胸骨旁短轴及心尖四腔切面进行观察，这三个切面显示较为稳定，心内膜显示清楚，易于测量观察。室壁厚度、EF值及FS值均通过胸骨旁长轴M型超声测得，乳头肌水平短轴切面观察左心室各节段运动最为适宜[2-4，6-7]。本研究发现心肌梗死模型建立后实验组IGFBP-4组及对照组小鼠均不同程度出现左心室前壁及前室间隔运动明显减低，无收缩或出现反向运动，说明两组小鼠心肌梗死模型建立成功。对照组及IGFBP-4组小鼠心功能与术前相比均有显著下降，表现为室壁变薄，心室腔明显扩大，室壁运动减低，EF及FS值均下降，说明两组小鼠已发生心室重构[8-9]。而至术后2周，对照组小鼠的心功能进一步恶化，而IGFBP-4组小鼠左心室腔未继续扩大，收缩功能也略好转，说明后者的心室重构中断并可能发生逆转，而对照组小鼠心室重构进展虽能够暂时代偿以保证心脏泵功能，但最终难免恶化为心力衰竭。基于这些实验结果，本研究推测IGFBP-4可能通过在心肌梗死发生的早期阶段下调β-catenin的表达，抑制Wnt信号通路的活化状态，从而参与细胞损伤修复，并进而阻止心肌梗死更长时间后心肌细胞DNA损伤的发生。本研究最后通过心肌组织的病理学检查，对左心室质量超声测量值及实测值之间的相关性检验进行验证，结果皆与超声心动图一致，都能够确认高频超声心动图对于实验模型心功能评估的可行性及可靠性。

图4　两组小鼠结扎手术前后组织病理学H-E染色检查与超声心动图检查结果Fig.4　Histopathological (H-E stain) and echocardiographic findings in two groups before and after operation

高频超声心动图以其高分辨率、简便无创等优点吸引了众多研究者的关注，广泛应用于各种实验动物的心脏功能评定[10-12]。高频超声心动图显著提高了超声检查的分辨率，更清晰地显示和测量实验动物心脏的二维结构，且系统提供的分析已经接近于临床所使用的检查数据分析模式，也因此能够提供更为客观的超声成像结果，是一种适用于早期准确监测引起动物模型心脏损害的有效方法[13]。

本研究尚有不足之处。(1) 对于小鼠模型观察周期较短，对于左前降支结扎后心功能的长期变化未能作出相应的评估；且受到切面限制，未能对除胸骨旁长轴、短轴及心尖四腔以外的切面上室壁运动情况，尤其是梗死节段心肌局部运动及功能作出评估。(2) 小动物超声获取的二维超声图像依然不够清晰，虽然本研究采用的超声频率已达30MHz，但是在显示心脏更加细微结构方面仍感欠缺。期望未来改进小动物超声图像的分辨率，获得更加清晰的图像，以更加准确地评价小动物心功能变化。

综上所述，IGFBP-4可能通过在心肌梗死发生的早期阶段下调β-catenin的表达，抑制Wnt信号通路的活化状态，从而参与细胞损伤修复，并进而阻止心肌梗死更长时间后心肌细胞DNA损伤的发生。而高频超声心动图安全无创、动态实时并且可重复性强，为评价IGFBP-4转基因小鼠心肌梗死模型心脏功能的变化提供了可靠的方法。