一种具有磷酸酶活性的金黄色葡萄球菌蛋白的初步鉴定

于立权 吕茂丽 吴志军 刘振华 李玉环 崔玉东

摘 要：金黄色葡萄球菌是一种人畜重要的致病微生物，寻找新型药物靶标是及时有效治疗金黄色葡萄球菌感染的潜在途径。本实验依据数据库，体外设计并合成了一对特异引物，应用PCR方法扩增出一种新的磷酸酶基因，并将该基因克隆至表达载体pET2a上。经测序、酶切和PCR鉴定正确后转化大肠杆菌感受态细胞BL21中，经IPTG体外诱导表达出重组蛋白并对其进行了磷酸酶活性测定。结果表明：该基因编码蛋白具有更多依赖于镁离子的磷酸酶活性，这种酶活性受到特异性抑制剂氟化钠的抑制。研究结果为进一步挖掘该蛋白作为金黄色葡萄球菌感染有效治疗药物靶点提供了数据资料。

关键词：金黄色葡萄球菌；磷酸酶；酶活性

中图分类号 R378 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）07-0028-3

Elementary Identification of Activity of Phosphatase of Protein from Staphylococcus aureus

Yu Liquan et al.

（College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，China）

Abstract：Staphylococcus aureus is an important pathogenic microorganism，and the exploration of novel drug targets is a potential way to effective timely conduct the infection of Staphylococcus aureus. Based on the database，a pair of special primers were designed and synthesized in vitro. A new phosphatase gene was amplified by PCR，and the target gene was cloned to the vector pET2a. After sequencing，enzyme digestion and PCR identification，the recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli BL21. The recombinant protein was induced by IPTG in vitro and the activity of enzyme was determined. The results showed that the protein coded by the target gene had activity of phosphatase which was more dependent on magnesium ion. The activity of protein enzyme was specific inhibited by sodium fluoride. The results provide data for the further excavation of this protein as an effective therapeutic drug target for Staphylococcus aureus infection.

Key words：Staphylococcus aureus；Phosphatase；Enzyme activity

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是人畜重要的致病微生物，能引起广泛的人畜局部或全身感染而导致疾病发生[1，2]，如畜牧业上奶牛乳房炎和子宫内膜炎[3]、医院或社区内肺炎[4]、败血症和脓毒症[5]等感染性疾病。随着大量头孢菌素尤其是第三代头孢菌素等高效广谱抗菌药物的大量使用和滥用，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株频现，多重耐药性增加，给人类公共卫生安全造成了极大的威胁[6]。因此，迫切需要寻找一种替代预防或治疗金黄色葡萄球菌感染的新型药物。

金黄色葡萄球菌含有很多致病因子，如溶血素、杀白细胞素、肠毒素等毒素[7]和凝固酶、耐热核酸酶、酚可溶性调节蛋白（PSM）等侵袭性酶类[8]。目前，虽然国内外对于金黄色葡萄球菌这些致病因子的分子特征、作用机制、临床应用潜能等方面研究较多[9-11]，但对于具有免疫抑制性和耐药性的金黄色葡萄球菌研究远远不够，需要进一步深入挖掘。

由磷酸激酶和磷酸酶控制的底物可逆磷酸化是细胞应对外界刺激的一个关键调控机制，可以使靶蛋白在活化与失活之间转换，从而实现胞内信号传导途径的激活或失活，进而调控着细胞的生长、增殖和胁迫响应[12]。越来越多的研究表明，磷酸酶在金黄色葡萄球菌中调控着压力胁迫感应和生物膜形成等许多细胞过程，并与毒力密切相关[13-15]。为深入探索磷酸酶在金黄色葡萄球菌可逆磷酸化信号通路中的功能和识别新药靶标，本实验体外克隆表达了一种具有磷酸酶活性的金黄色葡萄球菌蛋白并进行了活性测定，研究结果可为将来新型抗菌药物开发提供更多的科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒 实验中所用的金黄色葡萄球菌菌株Newman、大肠杆菌DH5α和BL21、质粒pET32a为本实验室保存。

1.2 工具酶和生化试剂等 限制性内切酶购自Thermo scientific公司，Taq DNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司，PMD18-T和T4 DNA连接酶购自大连宝生物公司。基因组提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒及胶回收试剂盒购自Axygen公司，蛋白磷酸酶测定试剂盒购自Promega公司。

1.3 引物设计 根据Pubmed数据库中一个假定的金黄色葡萄球菌磷酸酶的基因序列，利用Primer5软件设计相应的引物F1和R1，上游引物F1引入BamH I位点，下游引物R1引入Sal I位点。引物委托苏州金唯智生物科技有限公司合成。引物序列如下：

F1：5'-GCCGGATCCAAGATAGGGACAATCGCCG-3'，

R1：5'-GCGGTCGACAATTTCTATTATTTGTATCGTC

TC-3'。

1.4 磷酸酶基因的克隆和验证 以基因组试剂盒提取的金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增。反应条件为：95℃预变性5min，然后95℃ 30s，60.3℃ 30s，72℃ 1min，共30个循环，末次循环后72℃延伸5min。PCR反应结束后，产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。将用PMD18-T载体进行TA克隆的重组质粒进行测序。将测序正确的重组质粒和载体pET32a分别进行BamH I/Sal I双酶切，回收纯化后进行连接转化大肠杆菌。用酶切和PCR方法验证阳性克隆。

1.5 磷酸酶基因的原核表达 以1：100稀释过夜培养的重组菌，接种于含有100μg/ml氨苄的LB液体培养基中培养。当菌液OD600达到0.5时，加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导。将菌体离心收集后超声裂解，SDS-PAGE电泳分析。在进行酶活性测定时，大量表达的蛋白是以包涵体形式存在的。实验中用含8M尿素的缓冲液溶解包涵体，再缓慢稀释至溶液中尿素终浓度为2M。

1.6 酶活性测定 按照磷酸酶测定试剂盒的说明书进行。实验中分别设置组别为：酶、底物、酶+底物、酶+底物+氯化镁、酶+底物+氯化镁+氟化钠、酶+底物+氯化锰、酶+底物+氯化锰+氟化钠。每组样品加入缓冲液后37℃反应3min，随后加入终止液室温作用15min。酶标仪测定OD600nm值，根据标准曲线换算成磷酸根浓度。实验重复3次。

2 结果与分析

2.1 磷酸酶基因的PCR扩增与重组质粒的酶切鉴定 以金黄色葡萄球菌Newman基因组为模板，PCR扩增得到约800bp的目的条带（图1）。将TA克隆的重组质粒进行测序后，显示序列全长为804bp，其核苷酸序列与NCBI数据库上相对应的核苷酸序列同源性达100%。将用pET32a载体亚克隆得到的质粒转化大肠杆菌BL21，小量培养后提取质粒，BamH I/Sal I双酶切后获得约0.8kb和约5.9kb大小两条条带，与预期结果一致（图2），说明重组表达质粒构建成功。

2.2 磷酸酶的大肠杆菌异源表达 将构建好的重组表达质粒转化BL21菌株，以1M浓度的IPTG进行诱导表达。同时设未转入空载体空菌和转入空载体的BL21做对照。结果显示，通过设定的不同诱导时间诱导，重组蛋白均有很好表达，且随着时间的延长，重组蛋白表达量并没有发生显著变化。在空菌和含有表达载体pET32a的菌体中，均可见在约在34kDa左右有菌体本身的一种蛋白存在。我们表达的目标蛋白的电泳行为正好与该蛋白的电泳行為相似（图3）。可以判断，在IPTG诱导的重组菌体中，实际重组蛋白是诱导表达的，这在后续的酶活性测定中可以间接说明这一点。

2.3 磷酸酶的酶活性体外测定 大量表达的包涵体蛋白用尿素溶解稀释后，应用商品化试剂盒，对合适浓度的蛋白进行了酶活性测定。当仅仅加入酶或和底物时，反应体系中游离磷酸的含量很低。但加入Mg2+后，酶与底物寡肽反应释放的游离磷酸量增高，达到0.34%，加入磷酸酶特异性抑制剂NaF后，反应体系中的酶活性受到抑制，降到仅仅加入酶或和底物时的水平。加入Mn2+后，酶与底物寡肽反应释放的游离磷酸量增高，达到0.36%，增高的量略大于加入Mg2+增高的量的水平，加入磷酸酶特异性抑制剂NaF后，反应体系中的酶活性受到稍微抑制，说明该蛋白的酶活性主要依赖于Mg2+（图4）。

3 结论与讨论

因金黄色葡萄球菌感染导致的疾病类型多样，病情复杂。同时，由于当今临床上激素、抗生素等的过度应用，金黄色葡萄球菌耐药菌株特别是多重耐药菌株的频现，迫切需要新型的金黄色葡萄球菌感染预防治疗药物和全新的治疗方案[16，17]。

虽然对于金黄色葡萄球菌的致病机理等研究较多[8，10]，但对于关乎金黄色葡萄球菌致病力的磷酸化信号转导通路的研究依然很少[13，15]，需要深入挖掘磷酸化相关节点蛋白[18]，进而研究这些蛋白在金黄色葡萄球菌致病力中的贡献，来发现和识别新型药物靶标。

本研究对Pubmed数据库中一种生物信息学分析具有磷酸酶活性的金黄色葡萄球菌蛋白进行了体外克隆表达并进行了酶活性分析，初步鉴定为一种更多依赖Mg2+活性的磷酸酶，这种酶活性受到特异性抑制剂NaF的抑制。研究结果为将来开展一系列针对金黄色葡萄球菌磷酸酶为药物靶点的筛选工作奠定了基础。

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（责编：施婷婷）