Ghrelin对绵羊卵母细胞体外成熟的影响

王大清 郭继彤 李喜和 赵高平 曹贵方

摘 要：該研究旨在探讨外源Ghrelin对绵羊卵母细胞体外成熟的调控作用。在成熟培养液中分别添加浓度为0、100、200和300ng/mL的Ghrelin，进行绵羊卵母细胞体外培养，成熟培养24h，观察统计处于MII期的细胞数目。选择最佳添加浓度，在体外成熟培养0、6、8、14、16、24h，通过Hoechst33342染色持续检测卵细胞中细胞核成熟随时间变化，并对不同培养时期细胞进行实时荧光定量PCR检测，以证明细胞质量相关基因的相对表达量。成熟培养24h时，添加0、100、200、300 ng/mLGhrelin组卵母细胞成熟率分别为：63.7% （220/345） 、69.4%（230/332）、85.6% （270/316）、75.9%（231/305）。200ng/mL Ghrelin组显著高于对照组（P<0.01），其余组并未显著高于对照组 （P<0.05）；染色证明：200ng/mL Ghrelin组于成熟培养0h、6h、14h、16h到达GV、GVBD、MI、MII期（P<0.05）；实时荧光定量PCR证明：对卵母细胞成熟GV、GVBD、MI、MII 期，Ghrelin受体基因GHSR-1a和卵母细胞质量相关基因OCT-4、GLUT1 和IFNT 的相对表达时间提前，但并不显著影响这些基因的表达水平。外源 Ghrelin参与了绵羊卵母细胞的体外成熟调控，可在没有改变其成熟过程的前提下加速卵母细胞的体外成熟过程，但对绵羊卵母细胞的质量和进一步发育相关的基因的表达没有明显影响。

关键词：绵羊卵母细胞；Ghrelin；体外成熟

中图分类号 S826 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）07-

Effects of Ghrelin on in Vitro Maturation of Ovine Oocytes

Wang Daqing1 et al.

（1College of Life Sciences，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China）

Abstract：To study the regulation effect of exogenous Ghrelin in vitro maturation of sheep oocytes，0，100，200 and 300 ng/mL Ghrelin were added in mature culture medium，in vitro culture of sheep oocytes and 24h in mature culture，and the observation statistics were in the number of MII period. To choose the best dosage and mature in vitroculture 0，6，8，14，16，24 h，continuous detection of egg in the nucleus by dyeing Hoechst33342 mature and change over time，and the real-time fluorescent quantitative PCR to detect cell culture period，to show that cell quality relative expression of related genes. When the mature culture was incubated for 24h，the maturation rate of the oocytes of 0，100，200，300ng/mLGhrelin group was 63.7%（220/345），69.4%（230/332），85.6% （270/316） and 75.9%（231/305）. The 200ng/mL Ghrelin group was significantly higher than the control group（P<0.01），while the remaining group was not significantly higher than the control group （P<0.05）. The results showed that 200 ng/mL Ghrelin group was established in mature culture 0h，6h，14h，16h to GV，GVBD，MI，MII （P<0.05）. Real-time fluorescent quantitative PCR to prove：the GV oocytes mature，GVBD，MI，MII，Ghrelin receptor gene GHSR - 1a and oocyte quality related gene OCT - 4，the relative expression of GLUT1 and IFNT ahead of time，but not dramatically affect the gene expression level.exogenous Ghrelin participated in the sheep oocyte in vitro maturation regulation，under the premise of no change in the mature process can be accelerated in vitro maturation of oocytes，but the quality of sheep oocytes and related gene expression did not significantly affect the further development

Key words：Sheep oocytes；Ghrelin； In vitro maturation

Ghrelin是日本科学家Kojima于1999年首次发现的一种由28个氨基酸组成的新的内源性脑肠肽，是生长激素促分泌素受体（Growth hormone secretagogue receptor，GHSR）的天然配体[1]。Ghrelin在体内分布广泛，可能参与了多种组织的生理功能调控[2]。那么，Ghrelin在卵母细胞体外成熟培养作中扮演着何种角色，探索外源Ghrelin对绵羊卵母细胞体外成熟的调控機理对其后的体外受精、胚胎发育、转基因克隆等技术有着重要意义。近来研究证实：Ghrelin参与了哺乳动物生殖功能的调控[3]。在不同动物物种中其作用不尽相同。在猪卵母细胞体外成熟培养时添加Ghrelin可提高猪体外受精和孤雌胚胎的囊胚发育率[4]；而在牛卵母细胞体外成熟培养液中，Ghrelin除了可加速卵母细胞的体外成熟，还抑制了其后体外受精胚胎的囊胚发育[5]。在绵羊卵母细胞体外成熟和受精卵的体外培养过程中添加低浓度Ghrelin可提高体囊胚的体外发育率，但高浓度则抑制外胚囊胚的发育[6]。

本研究在绵羊卵母细胞体外成熟培养液中分别添加不同浓度的Ghrelin，检测并观察不同浓度Ghrelin对绵羊卵母细胞体外成熟率和卵母细胞核成熟时间的影响，筛选提高绵羊卵母细胞完全体外成熟率的最佳外源Ghrelin浓度。同时用实时荧光定量PCR技术对卵母细胞成熟不同时期细胞质量相关基因的相对表达量进行了动态检测，探讨Ghrelin与绵羊卵母细胞体外成熟时期的相关性，认识并了解Ghrelin影响绵羊卵母细胞成熟的作用机理。进而通过在绵羊卵母细胞成熟培养液中添加最佳外源Ghrelin浓度，来有效提高绵羊卵母细胞体外成熟数量和质量，为其后的体外受精、胚胎发育、转基因克隆等技术提供最基础、最有效保障。

1 材料与方法

1.1 实验材料 实验外源添加Ghrelin（PGH-3625-PI）购置于Peptides公司。HM199、M199、EGF、LH、DPBS、Gentamicin购于Gibco公司。胎牛血清是Biological Industries公司产品。The RNeasy? Mini Kit（cat.nos.74104）试剂盒购于Qiagen公司。GoScriptTM Reverse Transcription System试剂盒购于Promega公司。体视显微镜SMZ745T是Nikon公司生产。Real-Time PCR 仪（5100型号）是Thermo公司生产。微孔板迷你离心机（ZHmini-p25）为浙江藏汉科技有限公司产品。CO2培养箱（NUAIR-NU-5510E型号）为NUAIRE公司产品。绵羊卵巢采集自内蒙古和林格尔内蒙古蒙羊牧业股份有限公司屠宰车间。采集的卵巢置于含0.3mg/mL庆大霉素的生理盐水，在22℃的保温桶中1h内运回实验室。

1.2 实验方法

1.2.1 绵羊卵母细胞的采集和体外成熟培养 将运回实验室的绵羊卵巢先用75%酒精浸泡20～30s，之后用DPBS清洗3次，置于割卵液（90%HM199+10%FBS+2.5μg/mL

Heparin+50μg/ mLGentamicin）中，采用切割法收集2～6mm直径的卵泡中的卵丘卵母细胞复合体（Cumulus oocyte complexes，COCs），在体视镜下挑选具有3层以上卵丘细胞、胞质均匀、形态正常的卵母细胞用于成熟培养。每50枚COCs放于含有600μL基础成熟培养液（90%M199+10%FBS+0.3mm/mLSodiumpyruvate+0.1mm/mLCysteamine

+5μg/mLFH+5μg/mLLH+10μg/mLEGF+1μg/mLE2+50μg/mL

Gentamicin）的4孔板（Corning）中，4孔板中央添加2.5mL超纯H2O，在38.5℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中进行成熟培养。为了比较不同浓度梯度Ghrelin对绵羊卵母细胞体外成熟的影响，分别设基础成熟培养液中添加100、200、300ng/mL Ghrelin为实验组；基础成熟培养液中添加0ng/mL Ghrelin为对照组。然后分别于成熟培养24h收集培养的卵母细胞。统计卵母细胞处于：MII期成熟率百分比及标准误差。

1.2.2 绵羊卵母细胞核成熟进程的检测 基础成熟液中添加0ng/mLGhrelin和200ng/mLGhrelin组，分别设为：对照组、实验组。在荧光显微镜下，持续观察对照组与实验组中卵母细胞成熟过程中核发育形态随时间的变化，以确定对照组、实验组卵母细胞核成熟期（GV、GVBD、MI、MII）进程随时间的变化。并于成熟培养0h、8h、16h、24h；0h、6h、14h、16h后分别收集各时间培养卵母细胞各100枚，分别放在含有0.1%透明质酸酶的培养液中振荡去掉卵丘细胞，DPBS+0.3%BSA洗1遍，在加有PBS+4%多聚甲+0.2%TritonX-100的4孔板中，38.5℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中固定通透1h，PBS+0.3%BSA洗3遍（0.3%的BSA起到封闭作用），用Hoechst 33342（5mg/mL）染色检查卵母细胞核成熟GV、GVBD、MI、MII期核成熟进程。最后，用甘油：PBS按1∶1配制的封片液封片。荧光显微镜400倍下，观察核发育形态变化。并3次重复，统计不同核形态时期卵母细胞数目随时间变化。

1.2.3 绵羊卵母细胞总RNA提取、反转录及OCT-4、GLUT1、IFNT、GHSR-1a、GHSR-1a和GAPDH基因的荧光定量PCR检测

1.2.3.1 绵羊卵母细胞总RNA提取及反转录 按照The RNeasy? Mini Kit（cat.nos.74104）微量RNA提取试剂盒的说明书从不同体外成熟培养实验组及对照组中提取总RNA。然后，将总RNA按照GoScriptTM Reverse Transcription System试剂盒的说明书反转录为cDNA。-20℃保存，用于实时荧光定量PCR检测。

1.2.3.2 实时荧光定量PCR引物设计 引物设计依据美国GenBank 公布的基因的序列，使用Primer6.0软件计所需引物。引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。引物序列（见表1）。

1.3 统计学分析 运用统计学软件SPSS17.0软件对实验数据进行统计分析。统计程序为：单因子方差分析（one-way ANOVA）、Tukey，s Multiple Comparison test。数据表示分别以：百分比：%和标准误差：SEM；即：%±SEM，且每组卵母细胞个数多余100个，每组間重复3次，组间重复3次；t检验结果表示：a，p<0.01时为差异极显著；b，p<0.05时为差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同浓度Ghrelin对绵羊卵母细胞体外成熟的影响 于体外成熟培养24h后收集培养的卵母细胞，统计卵母细胞处于MII期百分比。对照组：63.7%（P<0.05）；添加100ng/mL Ghrelin组：69.4%（P<0.01）、添加200ng/mL Ghrelin组：85.6%（P<0.01）、添加300ng/mL Ghrelin组：75.9%（P<0.01）。结果表明：添加100、200、300ng/mL Ghrelin在绵羊卵母细胞体外成熟培养均有一定的促进作用，其中添加200ng/mL Ghrelin组作用最为显著（P<0.01），其中添加300 ng/mL Ghrelin组、100ng/mL Ghrelin组作用次之（P<0.01）（见表2）。

2.2 卵母细胞核成熟随时间变化

2.2.1 Hoechst 33342对卵母细胞体外成熟培养细胞染色 结果显示：对照组（A、B、C、D）：卵母细胞于体外培养的0h到达卵母细胞生发泡期（GV）：A、8h到达卵母细胞生发泡破裂期（GVBD）：B、16h到达卵母细胞第一次减数分裂中期（MI）：C、24h到达卵母细胞第二次减数分裂中期（MII）：D；实验组（A′、B′、C′、D′）：卵母细胞于体外培养的0h到达GV：A′、6h到达GVBD：B′、14h到达MI：C′、16h到达MII：D′。结果表明：实验组卵母细胞成熟过程中，细胞核发育形态趋势和对照组基本一致（P<0.05）。

2.2.2 绵羊卵母细胞核成熟情况随时间变化 对照组：卵母细胞体外成熟培养0h：97%到达GV期（p<0.01）、8h：52.46%到达GVBD期（p<0.01）、16h：54.54%到达MI期（p<0.01）、24h：56.42%到达MII期（p<0.01）；实验组：卵母细胞体外成熟培养0h：92.54%到达GV期（p<0.01）；6h：62.77%到达GVBD期（p<0.01）、14h：66.84%到达MI期（p<0.01）、16h：64.03%到达MII期（p<0.01）。结果表明：实验组在没有改变卵母细胞成熟进程的同时，对绵羊卵母细胞体外成熟有一定的加速作用（见表3、4）。

2.3 卵母细胞成熟过程中OCT-4、GLUT1、IFNT、GHSR-1a、和GAPDH基因相对表达量 对照组（见图2）：卵母细胞成熟过程中，OCT-4在GV期、GVBD期、MI期、MII期相对表达量未见明显变化，在IVM过程中基本维持不变；GLUT1的相对表达量在GVBD期降低，MI期、MII期持续增加，MII期GLUT1的相对表达量达到最大，为初始相对表达量的1.4倍；IFNT在GVBD期、MI期、MII期表达量不断增加，GVBD期IFNT的表达量为初始量的1.69倍，MI期为初始量的1.4倍，MII期达到最大，为初始量的1.75倍；Ghrelin受体GHSR-1a的相对表达量在IVM过程中呈缓慢递减趋势变化，Ghrelin受体GHSR-1a在MII期相对表达量递减趋势明显，为初始相对表达量的-0.2倍。实验组（见图3）：卵母细胞成熟过程中，Ghrelin受体GHSR-1a基因和卵母细胞质量相关基因OCT4、GLUT-1和IFNT随着卵母细胞成熟过程的表达动态。其中OCT-4在GV期、GVBD期、MI期、MII期相对表达量未见明显变化，GVBD期的相对表达量达到最高为初始表达量的1.2倍，OCT-4的相对表达量在IVM过程中基本维持不变；GLUT1的相对表达量在GV期、GVBD期，MI期、MII期持续快速增加，MII期GLUT1的相对表达量达到最大，为初始相对表达量的1.26倍；IFNT在GVBD期、MI期、MII期表达量不断增加，GVBD期IFNT的表达量为初始量的1.29倍，MI期为初始量的1.43倍，MII期达到最大，为初始量的1.90倍；Ghrelin受体GHSR-1a的相对表达量随着IVM时间的推进呈下降趋势变化，当到达MII期时Ghrelin受体GHSR-1a相对表达量到达相对表达量的最低点，为初始量的0.315倍。结果说明（见图2、图3）：在实验组并没有影响卵母细胞Ghrelin受体GHSR-1a基因和卵母细胞质量相关基因OCT4、GLUT-1和IFNT的表达水平，仅提前表达了相关基因的表达；GV期：实验组GHSR-1a基因相对表达量较对照组而言差异显著（p<0.05）、GVBD期：实验组GHSR-1a基因相对表达量较对照组差异极显著（p<0.01）、MII期：实验组GLUT1基因相对表达量较对照组差异显著（p<0.05）。

3 讨论

本研究证实添加Ghrelin对绵羊卵母细胞体外成熟具有促进作用，这与白瑞霞等[7]的研究结果相吻合，但对于Ghrelin的适宜添加量，各种报道中有所不同。本研究结果显示，添加200ng/mL的Ghrelin培养条件可获得理想的成熟效果，而王正光等[8]的研究则认为添加50ng/mL Ghrelin培养条件对卵母细胞的成熟及后续的胚胎发育最为合适的，这可能与不同实验室采用的培养体系有所不同有关。本研究就外源添加一定浓度Ghrelin对绵羊卵母细胞体外成熟培养的影响进行探索研究，以期为胚胎生产及细胞工程的基础研究进一步奠定一定的理论基础。

GHSR-1a是Ghrelin的一個受体亚型[9]，它的分布十分广泛，在多种分泌作用中发挥作用[10]。Ghrelin的生物学作用是通过与GHSR-1a受体特异性结合而实现得。与以前报道的研究结果一致[11]，本研究经过qPCR检测发现Ghrelin受体GHSR-1a在体外成熟培养条件下，其相对表达量均随着成熟进程的发育而减弱直到MII期达到最小，在添加Ghrelin后，GHSR-1a的表达提前了。这可能是由于添加外源Ghrelin后，刺激了Ghrelin受体GHSR-1a的表达，二者通过结合产生作用。而当卵母细胞成熟完成后，Ghrelin完成了对卵母细胞成熟的调节，或者是Ghrelin被消耗，而致使其受体的表达量也下降。这些都表明Ghrelin通过调节受体GHSR-1a的表达而参与了绵羊卵母细胞的体外成熟过程。

在早期胚胎发育过程中，Pit-oct-unc转录调控因子OCT-4的表达是胚胎发育的关键[12]，不仅如此，卵母细胞母源OCT-4的mRNA水平也是卵母细胞进一步发育所必不可少的[13]。也就是说，卵母细胞OCT-4的mRNA水平发生改变，会影响到卵母细胞的进一步发育。我们的研究发现成熟液中添加Ghrelin对母系来源的OCT-4没有影响。这表明添加Ghrelin，在提高绵羊卵母细胞体外成熟率的同时，不影响卵母细胞的质量，也不影响其后的进一步发育。

有研究发现GLUT1，一类协同转运蛋白超级家族的葡萄糖转运蛋白[14]，参与了卵母细胞和早期胚胎的代谢[15]。GLUT1影响卵母细胞的成熟和植入前胚胎的发育[16]，而且GLUT1的表达量和绵羊卵母细胞发育能力呈正相关[17]。本研究发现，卵母细胞体外成熟液中添加Ghrelin可以显著提高绵羊卵母细胞的成熟率，缩短卵母细胞成熟时间，期间GLUT1的表达也随着卵母细胞成熟进程的加快而提前。这可能是GLUT1通过调节滋养层细胞的作用，参与了卵母细胞的成熟调节[18]。本研究发现Ghrelin除了调节GLUT1基因的提前表达参与卵母细胞体外成熟外，也参与了IFNT基因表达的调节。IFNT基因是卵丘细胞的标记基因之一，在早期胚胎的表达有助于胚胎的植入识别[19]。

已有研究表明：IFNT最初是在绵羊孕体条件培养液中发现的[20]，参与多种功能的调节[21]。IFNT还与卵母细胞发育潜能相关[22]。本研究发现：IFNT和GLUT1基因的表达调节一样，Ghrelin通过调节IFNT基因的提前表达参与卵母细胞体外成熟，但不改变IFNT基因在卵母细胞成熟进程中的动态表达变化，从而维持卵母细胞提前成熟，而不改变其质量和进一步发育的能力。本研究通过比较发现不同浓度的Ghrelin对绵羊卵母细胞体外成熟有不同影响，一定浓度Ghrelin能显著提高卵母细胞的成熟率。在绵羊卵母细胞体外成熟培养液中添加一定浓度Ghrelin，绵羊卵母细胞的成熟时间缩短。这些结果表明，Ghrelin介导了绵羊卵母细胞的体外成熟培养，这可能是由于Ghrelin能促进绵羊卵母细胞的代谢，从而加快了卵母细胞的成熟。本试验为后续进一步研究外源Ghrelin对绵羊卵母细胞成熟机制及作用提供了基础，但详细的机制还有待进一步研究。

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（責编：张宏民）