黄芪多糖的提取、化学修饰和清除自由基作用

李清平，张海容

(忻州师范学院 生化分析技术研究所，山西 忻州 034000)

黄芪含香豆素、黄酮类化合物、皂甙及微量叶酸和数种维生素等[1]。味甘，微温，具有补气固表，托疮生肌、利水的功效，主治气血虚弱、自汗、久泻脱肛、子宫脱垂、肾炎浮肿、蛋白尿、糖尿病、慢性溃疡等症。多糖[2]是天然高分子化合物，存在于各种植物、动物、和微生物组织中，具有许多重要和独特的生理作用。自由基[3]是常见的生化反应的中间态物质,与机体许多功能障碍和疾病的发生密切相关.当人体内的自由基产生过度或清除过慢,就会加速机体的衰老过程，使各种细胞、器官受到损害，诱发各种疾病。DPPH·(二苯基苦肼基自由基)[4]在有机溶剂中是一种稳定的自由基,其孤对电子在517nm 附近有强吸收(显深紫色)。当有机清除剂存在时，孤对电子被配对,吸收消失或减弱，通过测定吸收减弱的程度，可评价自由基清除剂的活性[5]。DPPH·法用以评价天然抗氧化剂抗氧化活性的一种快速(反应时间仅需30min 左右)、简便、灵敏可行的方法。

1 实验

1.1 仪器

XA-1型固体样品粉碎机，金坛市荣华仪器制造有限公司；DZ-1A型真空干燥箱， 天津市泰斯特仪器有限公司；722S 可见分光光度计，上海青华科技仪器有限公司；RE-52旋转式蒸发器，上海安亭电子仪器厂；AB204-N电子分析天平，Mettler―Toledo Group。

1.2 药品

无水乙醇，分析纯(天津市北原方正试剂厂)；95%乙醇，分析纯(天津市化学试剂三厂);DPPH·，分析纯(东京化成工业株式会社)；葡萄糖，分析纯(新乡市化学试剂厂)；正丁醇，分析纯(天津市化学试剂三厂)；三氯甲烷，分析纯(天津市化学试剂三厂)；异丙醇，分析纯(天津市北辰方正制药厂)；氢氧化钠，分析纯(天津市北辰方正制药厂)；氯乙酸，分析纯(天津市化学试剂三厂)；甲醇， 分析纯(天津市化学试剂三厂)；黄芪(忻州惠康药店)。

1.3 实验方法

1.3.1 黄芪多糖的提取

粗多糖的提取:称100 g黄芪粉末，用十倍水在水浴中煮沸20 h，过滤后将残渣再次加十倍水水浴中煮沸20 h，合并两次滤液，用旋转蒸发仪蒸发到200 mL；

纯化：用Sevag法去蛋白两次，至溶液分两层，取水相，加入800mL的95%乙醇沉淀，真空干燥，得去蛋白黄芪多糖5.012 g，样品呈褐色；

多糖分级：加热水将多糖溶解，除去不溶物，上层清液用于分级。乙醇终浓度达到50%时离心，得沉淀即H1；上清液浓缩，沉淀即H2。

1.3.2 对黄芪多糖H1的化学修饰

称取0.3 g多糖(H1)在8 mL异丙醇剧烈搅拌，形成浆状。室温下在30min内慢慢加入0. 8 mL 30%氢氧化钠溶液，继续搅拌1 h，然后在30min内加入0.36 g氯乙酸。混合液置于100 mL烧杯中，用滤纸包住，55℃烘箱中放置3.5 h，去除液体，在70%甲醇中边搅拌边加入90%乙酸，以中和过量的氢氧化钠，得甲基化多糖。产物干燥后先用70%甲醇洗涤，再用绝对甲醇洗涤，在60℃干燥。

1.3.3 黄芪多糖对自由基的清除

DPPH·(二苯基苦肼基自由基)在有机溶剂中是一种稳定的长寿命自由基，其孤对电子在517nm附近有强吸收(显深紫色)。当有清除剂存在时，孤对电子被配对，吸收消失或减弱，通过测定吸收减弱的程度，可评价自由基清除剂的活性。DPPH·法用以评价抗氧化剂抗氧化活性是一种快速、简便、灵敏可行的方法。

原理：一个大分子的稳定自由基抗氧化剂预期作用模式为：

AH + DPPH·→ DPPH-H +A·

依据DPPH·具有单电子，在517nm处有一强吸收(深紫色)，当自由基清除剂与其单电子配对使其逐渐消失，其褪色程度与其所接受的电子数成定量关系，因而可用分光光度法进行定量分析。

步骤：分别取多糖溶液(1.2mg/mL)0.1，0.2，0.4，0.8，1.0，1.5，2.0mL及2×10-4mol·L-1的DPPH·溶液加入同一10mL比色管中，摇匀，30min后用同浓度的提取液作参比，测定吸光度A样品,同时用无水乙醇作参比，测定2 mL 2×10-4mol/L DPPH液与2 mL无水乙醇混合后溶液的吸光度A对照，根据下面的公式计算清除率：

A对照—指加入DPPH·的自由基体系的吸光度值；A样品—指加入不同提取液，DPPH·后自由基体系的吸光度值。

2 结果与讨论

2.1 黄芪多糖的提取及化学修饰

按照实验方法1.3.1提取黄芪粗多糖: 得去蛋白黄芪多糖5.012 g，样品呈褐色；热水将多糖溶解，除去不溶物，上层清液用于分级。乙醇终浓度达到50%时离心，得沉淀即H1；上清液浓缩，沉淀即H2。再按照实验方法1.3.2，称取0.3 g多糖(H1)在8 mL异丙醇剧烈搅拌，形成浆状。加入0.8 mL 30% 氢氧化钠溶液，继续搅拌1 h加入0.36 g氯乙酸。去除液体，加入90%乙酸，得修饰多糖。产物用70%甲醇洗涤，干燥，即得甲基化多糖0.56 g。

2.2 DPPH法测定黄芪多糖对自由基的清除作用

分别测定H1、H2和修饰多糖对自由基的清除率，并以葡萄糖溶液(1.2 mg/mL)的清除率为对照，结果如图1。

实验的结果表明，三种多糖相同体积时抗自由基能力：H2>甲基化>H1。它们对自由基的清除作用与其浓度呈正相关性，即随浓度的逐渐增加，清除率也逐渐增大。在浓度小于0.6 mg/mL时，甲基化多糖与H1有交叉重叠部分，且甲基化多糖略大于H1。H2与甲基化多糖的清除效率小于葡萄糖，这是因为葡萄糖有较强的还原作用。多糖由于在分级纯化过程中除去大部分糖肽、蛋白质(而这些成分一般具有较强的抗氧化性)，故总体清除效果变弱，但多糖其清除效果明一般优于维生素C、维生素E及黄酮类化合物，具有对自由基有明显化学作用而又不易被氧化的特点。

图1 H1、H2和甲基化多糖对DPPH自由基的清除率

3 结语与展望

黄芪多糖一般被用来制成注射液、口服液，但未见黄芪多糖修饰后药用性能变化的报道。本文通过提取黄芪多糖，以及对提取的多糖纯化、分级和修饰来全面研究黄芪多糖的药用价值。众所周知，各种中草药中含有多种抗氧化剂，天然抗氧化剂的应用在营养品、化妆品和医药及食品添加剂等方面都取得了可喜的进展，展示出广阔的应用前景，随着自由基和天然抗氧化剂研究的深入，天然抗氧化剂必将为人类的健康作出巨大贡献。而多糖由于其自身的特点更是倍受关注，做为一种方便制备的天然抗氧化剂将被作为重要资源而有广阔前景。

[1]张杰生,张童茜,安 宏.黄芪在心血管疾病治疗中的应用进展[J].中医研究,2012,25(8):78-80.

[2]吴 梅,谭 睿.黄芪多糖研究进展[J].川北医学院学报,2013,28(1):17-20.

[3]聂 挺.量子化学计算研究多酚及多肽清除自由基的构效关系[D].南昌:南昌大学,2016.

[4]李铉军,崔胜云.抗坏血酸清除DPPH自由基的作用机理[J].食品科学,2011(32):86-90.

[5]罗秋水,杜华英,熊建华,等.葛根异黄酮类化合物提取工艺优化及其抗氧化活性研究[J].中国食品学报,2015,15(2):104-110.