重氮偶联法测定水中亚硝酸盐氮的改进

闫坤朋，牛成洁，宋志文，徐爱玲，刘 洋

青岛理工大学环境与市政工程学院，山东 青岛 266033

水体中的氨氮、亚硝酸盐氮是水产养殖环境的主要有毒物质，亚硝酸盐氮能把血液中的血红蛋白氧化为高铁血红蛋白，使之失去与氧结合的能力。亚硝酸盐氮也是养殖水体主要的监测对象[1-3]。当水体受到生活污水、养殖废水、饲料生产与肉类加工等工业废水中含氮有机物污染后，在水体中产生氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮，亚硝酸盐氮作为水中氮循环的中间产物，是水环境监测的重要指标[4]。

亚硝酸盐氮的测定方法有离子色谱法[5]、气相分子吸收法[6]、分光光度法[7-8]。离子色谱法和气相分子吸收法简便、快速、准确、干扰较少，适用于环境水样的测定，但因需要使用专用仪器，且仪器昂贵，不利于一般实验室和基层检测单位的普及。在亚硝酸盐氮的测定方法中，分光光度法因其方法灵敏、选择性强、仪器较易获得、准确性良好而被实验室广泛采用，其方法原理：在磷酸介质中，亚硝酸盐氮与对氨基苯磺酰胺反应，生成重氮盐，再与N-(1-萘基)-乙二胺偶联生成红色染料，在540 nm波长处有最大吸收。但是该国标法的测定上限仅为0.2 mg/L，对于亚硝酸盐氮含量较高的水样则需稀释一定倍数甚至数次稀释才能进行测量，使测定过程更为繁琐，增大了测定误差，降低了测定的准确性。

为克服以上缺陷，本文将亚硝酸盐氮显色剂中的磷酸溶液改成盐酸溶液，将重氮试剂浓度提高到原国标法的3倍，研究该方法对亚硝酸盐氮检出上限以及灵敏度、准确度、精密度的影响，取各类含亚硝酸盐氮污水进行加标实验，并研究干扰因素对改进法测定的影响。

1 实验部分

1.1 主要仪器

UVmini-1240紫外-可见光分光光度计(Nichipet EX可调式移液器，日本)；电子天平。

1.2 试剂及溶液配制

国标法所用试剂、溶液等配制方法参考《水和废水监测分析方法》[9]：吸取亚硝酸盐氮标准中间液(50 mg/L)10 mL于100 mL容量瓶中，用水定容至标线，得到亚硝酸盐氮标准使用液1(5 mg/L)；吸取国标法中亚硝酸盐氮中间液(50 mg/L)10 mL于1 000 mL容量瓶中，用水定容至标线，得到亚硝酸盐氮标准使用液2(0.5 mg/L)。

改进法试剂、溶液的配制方法：取20 mL浓盐酸(37.5%)溶解于180 mL蒸馏水中，得体积比为1∶9的盐酸溶液；取15 g对氨基苯磺酰胺溶解于150 mL体积比为1∶9的盐酸溶液，得到混合液；在混合液中加入0.5 g盐酸萘乙二胺，混匀并添加蒸馏水定容至250 mL，得到改进法的亚硝酸盐氮显色剂。

1.3 实验方法

1.3.1 国标法亚硝酸盐氮标准曲线的绘制

按照国标法步骤进行实验，获得校正吸光度后，记录数据，用最小二乘法绘制出以亚硝酸盐氮浓度对校正吸光度的标准曲线，得出国标法校准曲线方程、相关系数[10]。

1.3.2 改进法亚硝酸盐氮标准曲线的绘制

根据邓勃的分析，在标准曲线的绘制过程中增加实验点数，可提高标准曲线的整体稳定性，校正曲线中央的精密度优于校正曲线两端的精密度[11]，故此实验标准曲线的绘制，从原国标法中的6个点增加到9个点，并将实验点集中于校准曲线的中央部分，具体操作如下：①向具塞比色管中分别移入0、0.5、1、2、3、4、5、6、7 mL亚硝酸盐氮标准使用液1(5 mg/L)于9支具塞比色管中，用去离子水稀释定容至50 mL，对应浓度分别为0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/L；②向各比色管加入改良亚硝酸盐氮显色剂1 mL，混匀，加塞静置15 min后测定，2 h内有效；③于分光光度计540 nm波长处，用光程10 mm的比色皿，以去离子水为参比，测定各浓度亚硝酸盐氮溶液的吸光度，从测得的吸光度，减去零浓度空白比色管的吸光度后，获得各浓度的校正吸光度；④记录数据，用最小二乘法绘制以亚硝酸盐氮浓度对校正吸光度的校准曲线，得出改进法校准曲线方程、相关系数。

1.3.3 国标法和改进法测定水样的比较

取一高浓度亚硝酸盐氮水样，分别用国标法和改进法对该水样稀释10倍、30倍、50倍、100倍、200倍进行测定，得出相应校正吸光度，计算各自亚硝酸盐氮浓度，乘以相应稀释倍数，得出不同稀释倍数下国标法、改进法对同一水样的测定结果，进行对比分析。

1.3.4 改进法检出限的测定

用改进法对去离子水进行20次空白测定，分析确定改进法对亚硝酸盐氮测定的检出限。

1.3.5 改进法检测结果的准确度、精密度

对已知浓度的亚硝酸盐氮标准溶液进行6次重复测定，计算平均值、相对误差、标准偏差、相对标准偏差。

1.3.6 改进法加标回收率

按改进法对各污水水样进行测定，并同时分别加入一定量的亚硝酸盐氮标准溶液做回收实验。

1.3.7 改进法干扰实验

国标法中测定亚硝酸盐氮时，水中的硫代硫酸盐、聚磷酸钠、高铁离子会对测定结果产生干扰。选用亚硝酸盐氮的标准水样，添加一定浓度梯度的硫代硫酸钠、三聚磷酸钠、高铁酸钠分别做干扰实验，检验各影响因素对改进法中的干扰影响。

2 结果与讨论

2.1 国标法亚硝酸盐氮校准曲线

按照1.3.1小节中的实验方法，所得结果如图1所示。可以看出，在亚硝酸盐氮为0～0.2 mg/L的浓度范围内，亚硝酸盐氮浓度与校正吸光度呈线性关系y=3.194 4x+0.007，相关系数为0.999 5，灵敏度为3.194 4。

图1 国标法亚硝酸盐氮校准曲线Fig.1 Nitrite nitrogen calibration curve of National standard method

2.2 改进法亚硝酸盐氮校准曲线

按照1.3.2小节中的实验步骤，绘制以亚硝酸盐氮浓度为x轴，以吸光度为y轴的改进法校准曲线，如图2所示。

图2 改进法亚硝酸盐氮校准曲线Fig.2 Nitrite nitrogen calibration curve of the improved method

在亚硝酸盐氮为0～0.6 mg/L的浓度范围内，亚硝酸盐氮浓度与吸光度的线性方程为y=3.090 7x+0.007 2，相关系数为0.999 4，呈现出很好的线性关系，与国标法相比，该改进法的测定上限提高了3倍，可能是重氮试剂浓度的增加，使更多亚硝酸盐氮产生重氮反应，提高了测定上限。标准曲线灵敏度为3.090 7，与国标法灵敏度(3.194 4)基本接近，极差仅为0.103 7，相对极差为3.22%，没有显著变化。

2.3 改进法亚硝酸盐氮的测定

2.3.1 国标法与改进法测定亚硝酸盐氮结果的比较

配制亚硝酸盐氮浓度为15 mg/L的标准溶液，将标准溶液准确稀释10倍、30倍、50倍、100倍、200倍，对国标法和改进法测定的亚硝酸盐氮浓度进行比较，结果如表1所示。按国标法测定时，将标准溶液稀释10倍、30倍、50倍，均超过校准曲线的线性范围，无法准确计算出亚硝酸盐氮浓度，因此需要继续稀释至100倍、200倍。但是由于稀释倍数过大，导致测定误差均超过5%，甚至超过10%，对于缺少精密移液器配置的实验室，误差将会更大，实现精密测定的难度明显加大；按改进法测定时，只有在水样稀释10倍时，测量结果超过校准曲线的线性部分，其他情况均可测定，当稀释30倍、50倍时，相对误差均低于5%，准确度良好。由此可知，按照改进法测定时可稀释的倍数范围明显加宽，节省了高浓度水样多梯度实验的时间和药剂，增强了实验的可操作性、准确性。

表1 国标法和改进法对亚硝酸盐氮测定结果的比较Table 1 Comparison of determination of nitrite with national standard method and improved method

注：“—”表示吸光度超过标准曲线线性范围。

2.3.2 改进法测定亚硝酸盐氮检出限

利用改进的亚硝酸盐氮显色剂对去离子水进行20次的空白测定，测得吸光度分别为0.050、0.053、0.049、0.048、0.049、0.050、0.052、0.048、0.050、0.050、 0.051、0.049、0.053、0.051、0.051、 0.048、0.047、0.048、0.051、0.050。按照《环境监测分析方法标准制修订技术导则》(HJ 168—2010)标准中方法检出限的一般确定方法，测定改进法的检出限[12]：

MDL=t(n-1，0.99)×S

(1)

式中：MDL为方法检出限，n为样品的平行测定次数，t(n-1，0.99)为自由度为(n-1)、置信度为99%时的t分布(单侧)，S为n次平行测定的标准偏差。当S=0.001 68，n=20，则t=2.539[10]。计算出改进法检出限为0.004 2 mg/L。

2.3.3 改进法准确度、精密度的测定

移取亚硝酸盐氮标准溶液2(0.5 mg/L)50 mL于6支具塞比色管中，用改进法测定亚硝酸盐氮浓度，测量结果如表2所示。其中，6次平行测定的平均值为0.508 mg/L，相对误差为1.60%，6组数据的相对标准偏差为1.34%。可见，改进法准确度、精密度良好，重复性、稳定性也较高。

表2 标准样品平行测定的结果Table 2 The parallel determination results of standard samples

注：平均值为0.508 mg/L，相对误差为1.60%，标准偏差为6.78×10-3，相对标准偏差为1.34%。

2.3.4 改进法的加标回收率实验结果

选取以海水养殖水、淡水养殖水、水族箱循环水为代表的养殖废水，以污水处理厂进出水为代表的生活污水，以污水厂排河尾水为代表的地表水，以食品加工废水为代表的工业废水，以污水厂排海尾水为代表的海水等各类水样测定亚硝酸盐氮的原始值，然后分别加入一定量的亚硝酸盐氮标准溶液做水样的回收实验，计算出加标回收率，测定结果见表3。各水样的加标回收率(n=9)均为97.0%～104.9%，可见，该改进法适用于生活污水、工业废水、地表水、养殖废水等常见污水的亚硝酸盐氮测定。

表3 水样加标回收率测定结果Table 3 The results of recovery rate in water samples

2.4 干扰因素对改进法测定的影响

取18支比色管，将3组干扰物质均配制成浓度梯度为0、0.05、0.1、0.15、0.3、0.5 mg/L分别添加至亚硝酸盐氮标准溶液2(0.5 mg/L)中，测定不同浓度的干扰物质对改进法亚硝酸盐氮测定的影响,结果如表4所示。结果显示，在实验浓度范围内，硫代硫酸钠对亚硝酸盐氮测定的影响不大，因此在水中硫代硫酸钠浓度低于0.5 mg/L时，可不做干扰处理；三聚磷酸钠在浓度大于0.15 mg/L后，随浓度升高，亚硝酸盐氮的测定结果逐渐降低，呈现负相关，影响亚硝酸盐氮的测定结果，而在三聚磷酸钠浓度低于0.15 mg/L时，对亚硝酸盐氮测定结果影响较小；高铁酸钠在浓度大于0.05 mg/L时，即会对亚硝酸盐氮的测定产生较大影响，随着高铁酸钠浓度的升高，亚硝酸盐氮测定结果越小。

表4 干扰物质对改进法测定亚硝酸盐氮的影响Table 4 Effect of interfering substances on determination of nitrite nitrogen by improved method

3 结语

提出了一种重氮偶联法测定亚硝酸盐氮浓度的改进方法，针对亚硝酸盐氮显色剂进行了改进，具体操作为取15 g对氨基苯磺酰胺溶解于150 mL体积比为1∶9的盐酸溶液，得到混合液，在混合液中加入0.5 g盐酸萘乙二胺，混匀并添加蒸馏水定容至250 mL，得到改进法的亚硝酸盐氮显色剂。亚硝酸盐氮的测定步骤不变。

1)通过改进，亚硝酸盐氮测定上限提高3倍。在测定高浓度水样时，减少了因稀释多梯度测定而耗费的时间，减少误差，简便操作。

2)改进法与国标法对比反应体系的灵敏度变化很小，改进法测定的准确度、精确度、稳定度良好，检出限为0.004 2 mg/L，测定上限为0.6 mg/L，加标回收率为96.5%～104.9%，适用于生活污水、工业废水、地表水、养殖废水等亚硝酸盐氮的测定。

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