渥曼青霉素通过Chemerin/CMKLR1途径抑制Kupffer细胞NLRP3的活性缓解小鼠非酒精性脂肪肝*

吴明兵，张文锋，龚建平，苗春木△

(1.重庆两江新区第二人民医院普外科 401123；2.重庆医科大学附属第二医院肝胆外科 400010)

大量的细胞因子和趋化因子参与了NAFLD的进展过程。Chemerin是一种新近被证实的参与NAFLD进展的趋化蛋白之一[3]。Chemerin还可能通过调控脓毒症患者糖代谢过程影响患者的生存时间[4]。此外，LPS可上调巨噬细胞表面Chemerin样受体(chemokine-like receptor 1，CMKLR1)的表达[5]。因此，Chemerin参与机体炎性反应中代谢紊乱的调节。但是，Chemerin是否能诱导KCs激活，以及其在单纯非酒精性脂肪肝向非酒精性脂肪性肝炎转变过程中的作用如何，目前鲜有报道。

最近，磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)抑制剂被报道具有减少脂肪的功能[6]。但是，PI3K抑制剂是否可通过减轻KCs诱导的炎性反应缓解NAFLD的进展，目前尚不清楚。因此，本研究将利用PI3K抑制剂渥曼青霉素(wortmannin)作用于体外预先用Chemerin处理的KCs模型，以及腹腔注射NAFLD小鼠模型，通过KCs介导固有免疫反应相关蛋白的变化，研究和探讨Chemerin参与NAFLD进展的机制。

1 材料与方法

1.1动物 本实验所用的C57BL/6J小鼠(4周龄，13～15 g，雄性)均购买于重庆医科大学动物实验中心。小鼠饲养在具有昼夜固定周期的独立通风笼盒(IVC)动物房中，可自由进食和饮水。所有与小鼠有关的操作均得到重庆医学大学动物伦理委员会批准，以及所有涉及小鼠的操作均符合动物伦理学相关规定。

1.2试剂 LPS(L5293)购买于美国Sigma公司。渥曼青霉素(S2758)购买于美国Selleck Chemicals公司。Chemerin活性成分Chem157S(SRP6002)和Ⅳ型胶原酶(C5138)购买于美国Sigma公司。鼠白细胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(EK0394)、鼠Chemerin ELISA试剂盒 (EK1330)、兔抗β-actin抗体(BM0626)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(BA1050)和RIPA裂解液(AR0102)均购买于武汉博士德科技公司。鼠IL-18 ELISA试剂盒(C507380)和基因引物序列均购买于上海生工生物科技公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒(KGP902)和超敏型ECL化学发光试剂盒(KGP1127)均购于江苏凯基生物技术公司。总RNA提取试剂盒(RP5612)、cDNA反转录试剂盒(PR6102)和荧光定量聚合酶链式反应(fluorescence quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR)试剂盒(PR7702)均购于北京百泰克生物技术公司。兔抗CMKLR1抗体(ab199603)、兔抗炎症小体3样受体蛋白(nucleotide oligomerization domain-like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3)抗体(ab214185)购买于美国Abcam公司。兔抗caspase 1 p10(67314)抗体购买于美国CST公司。

1.3方法

1.3.1KCs提取与培养 KCs的分离和培养参考课题组LI等[7]的报道，即C57BL/6J小鼠乙醚吸入麻醉后，常规备皮、消毒，并逐层剪开皮肤、肌层，以暴露腹腔、肝脏和门静脉。5 mL磷酸盐缓冲液(PBS)经门静脉原位灌注肝脏，同时开放上腔静脉。然后，游离肝组织，并在0.1%的Ⅳ型胶原酶浸润下离碎肝组织，之后在37 ℃水浴中消化30 min。所得的组织匀浆通过一个200目的滤网过滤，之后利用密度梯度离心法纯化。最后，分离得到的细胞沉渣可继续用来培养，或者提取总蛋白和总RNA。

1.3.2Chemerin和渥曼青霉素体外刺激KCs实验 关于Chemerin刺激实验，即KCs用梯度浓度的Chem157S(0、150、300 ng/mL)处理12 h后，FQ-PCR和蛋白印记法(Wester blot)分别检测CMKLR1的mRNA与蛋白表达水平进行后续实验的作用浓度的判断。关于渥曼青霉刺激实验，即KCs用渥曼青霉素(100 nmol/L)预处理1 h后，再用Chem157S刺激12 h。收集细胞上清液，提取细胞总RNA和总蛋白。

1.3.3动物分组与处理 20只C57BL/6J小鼠分为4组，每组5只：即标准饲养组(standard diet group，SD组)，即小鼠每天以正常饲料喂养；单独渥曼青霉素处理组(WOR组)，即渥曼青霉素(0.7 g·kg-1·d-1)腹腔注射小鼠12周；高脂饲料饲养组(HFD组)，即小鼠每天以高脂饲料(24%蛋白质、41%碳水化合物和24%脂肪)喂养；高脂饲料饲养结合渥曼青霉素处理组(TRE组)，即小鼠每天喂以高脂饮食，同时以腹腔注射渥曼青霉素(0.7 g·kg-1·d-1)12周。渥曼青霉素安全有效剂量参考VISSER等[8]的报道。此外，SD和HFD组小鼠每天以腹腔注射等量的生理盐水12周作为对照。各组小鼠均于12周后人道处死：收集小鼠血清以检测肝功能和细胞因子，收集肝组织标本以分离KCs和进行组织学检测。

限定词是用来引导名词的辅助词类，表达主有、指示、疑问等关系的词汇意义。在法语中，限定词包括冠词和传统语法称为非品质形容词的主有、指示、疑问、感叹、数目和泛指形容词。而英语的限定词则包括定冠词、不定冠词、零冠词以及物主、指示、关系、疑问和不定限定词等。

1.3.4葡萄糖和胰岛素耐量试验 葡萄糖耐量试验，各组小鼠禁食8 h，经腹腔注射葡萄糖(1.5 g/kg)。在胰岛素耐量试验，即小鼠禁食4 h，腹腔注射胰岛素(0.7 IU/kg)。分别在葡萄糖或胰岛素注射后0、30、120 min收集小鼠外周静脉血，利用便携式血糖仪检测血糖水平。

1.3.5ELISA试验和肝功能检测 用以检测IL-1β和IL-18水平的上清液和血清稀释20%后，利用市售ELISA试剂盒测定。用以检测Chemerin的血清，其浓度调整为原液的50%后，利用市售ELISA试剂盒测定。ELISA检测中涉及的所有的操作均严格按照试剂盒说明书进行操作。小鼠肝功能指标丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)和三酰甘油(triglyceride，TG)由美国贝克曼全自动生化分析仪检测。

1.3.6FQ-PCR检测 KCs(1×106)利用总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA并测定浓度后，进行cDNA反转录实验：即20 μL反应体系(1 μg总RNA、10 μL Reverse transcriptase MIX、1 μL FQ-PCR引物和ddH2O)进行50 ℃ 5 min，72 ℃ 2 min反应。然后，进行FQ-PCR：20 μL体系包括10.0 μL 2×Plus SYBR real-time PCR mixture、0.5 μL上游引物(10 μmol/L)、0.5 μL下游引物(10 μmol/L)、1.0 μL cDNA模板、10 μL ddH2O。反应条件为：94.0 ℃,2 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃、30 s，进行45循环反应。最后，利用公式进行定量分析。

2-△△Ct=2-[(Ct目的-Ct内参)实验组-(Ct目的-Ct内参)]

CMKLR1上游引物序列5′-ATG GAG TAC GAC GCT TAC AAC G-3′，下游引物序列5′-GGT GGC GAT GAC AAT CAC CA-3′，大小为192 bp；GAPDH上游引物序列5′-AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG-3′，下游引物序列5′-TGT AGA CCA TGT AGT TGA GGT CA-3′，大小为123 bp。

1.3.7Western blot检测 用RIPA裂解液裂解细胞提取总蛋白，采用BCA法检测蛋白浓度并定量。然后，10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)垂直电泳：100 V，120 min。接着进行转膜：250 mA，110 min。然后，利用5%脱脂奶粉室温封闭丙聚偏氟乙烯(PVDF)膜2 h；一抗4 ℃孵育16 h以上；PVDF膜洗涤后，加辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗室温孵育1.5 h后，利用增强化学发光(ECL)法进行显影。蛋白半定量分析，目的条带灰度值与相应β-actin条带灰度值的比值即为目的蛋白相对表达量。

2 结 果

2.1Chemerin诱导体外KCs炎症小体的激活 梯度浓度(0～600 ng/mL)的Chemerin刺激12 h后，体外KCs的CMKLR mRNA和蛋白的表达水平在随着Chemerin浓度升高而提高。但当Chemerin浓度上升至600 ng/mL时，CMKLR的mRNA和蛋白的表达水平将不再升高(图1A、B)。当用300 ng/mL的Chemerin刺激KCs时，细胞上清中IL-1β和IL-18水平明显高于正常KCs，且NLRP3和caspase 1 p10蛋白表达水平亦明显高于正常KCs(图1C～E)。因此，浓度为300 ng/mL的Chemerin可作为体外刺激KCs而引起炎症小体激活的适当浓度。

A:FQ-PCR分析图;B、E:Western blot;C、D:ELISA分析图；a:P<0.05

图1 Chemerin诱导体外KCs炎症小体的激活

A:Western blot;B：FQ-PCR分析图；C、D：ELISA分析图；a:P<0.05

图2渥曼青霉素抑制由Chemerin诱导体外KCs炎症小体的激活

2.2渥曼青霉素抑制由Chemerin诱导体外KCs炎症小体的激活 利用渥曼青霉素预处理的Chemerin-KCs，其CMKLR1、NLRP3和caspase 1 p10的mRNA与蛋白的表达水平均明显低于单独使用Chemerin刺激组，且细胞上清液中IL-1β和IL-18水平明显低于单独使用Chemerin刺激组(图2)。因此，渥曼青霉素可抑制由Chemerin诱导体外KCs炎症小体的激活。

2.3渥曼青霉素缓解高脂饮食诱导的小鼠NAFLD HFD组小鼠体质量明显高于SD组，而WOR组小鼠体质量明显低于HFD组，而高于SD组小鼠(图3A)；HFD组小鼠肝脏指数明显低于SD组，WOR组小鼠肝脏指数明显高于HFD组，而低于SD组小鼠(图3B)；HFD组小鼠葡萄糖耐受能力影响低于SD组小鼠，而WOR组小鼠葡萄糖耐受能力明显高于HFD组，而明显低于SD组小鼠(图3C)；HFD组小鼠胰岛素耐受能力低于SD组小鼠，而WOR组小鼠胰岛素耐受能力明显高于HFD组，而明显低于SD组小鼠(图3D)；HFD组小鼠的ALT、AST、TG和NAS评分明显高于SD组小鼠，而WOR组小鼠的ALT、AST、TG和NAS评分明显低于HFD组，而明显高于SD组小鼠(图3E～H)；HFD组小鼠肝组织脂肪变和炎症细胞聚集均明显多于SD组小鼠，而WOR组小鼠肝组织脂肪变和炎症细胞聚集均明显少于HFD组，明显多于SD组小鼠(图3I)；以上变化差异均有统计学意义(P<0.05)。利用渥曼青霉治疗高脂饲料喂养的小鼠，可明显减低小鼠体质量、提高肝脏指数，改善肝功能(ALT、AST和TG)，并且缓解肝组织的脂肪变性、葡萄糖和胰岛素抵抗。

A:体质量分析；B:肝脏指数分析；C:小鼠葡萄糖耐受能力分析；D:胰岛素耐受能力分析；E:ALT;F:AST;G:TG;H:NAS评分；I:HE染色;a:P<0.05

图3渥曼青霉素缓解高脂饮食诱导的小鼠NAFLD

A:Western blot;B:FQ-PCR;C～E:ELISA分析结果图；a:P<0.05

图4渥曼青霉素抑制高脂饮食诱导的KCs炎症小体激活

2.4渥曼青霉素抑制高脂饮食诱导的KCs炎症小体激活 HFD组小鼠KCs中CMKLR1、NLRP3和caspase 1 p10的蛋白和mRNA相对表达量明显高于SD组，而WOR组小鼠KCs中CMKLR1、NLRP3和caspase 1 p10的蛋白和mRNA相对表达量明显低于HFD组，而高于SD组(图4A、B)；HFD组小鼠血清中IL-1β和IL-18的水平明显高于SD组，而WOR组小鼠血清中IL-1β和IL-18的水平明显低于HFD组，而高于SD组(图4C、D)；以上变化，差异均有统计学意义(P<0.05)。利用渥曼青霉治疗高脂饮食饲养的小鼠，可明显抑制KCs中CMKLR1、NLRP3和caspase 1 p10 mRNA与蛋白的表达，以及降低血清中IL-1β和IL-18水平。见图4。

3 讨 论

本研究利用Chemerin刺激体外KCs，观察到了CMKLR1表达升高及NLRP3炎症小体激活。而PI3K的抑制剂渥曼青霉素可抑制Chemerin诱导的炎症小体激活。此外，渥曼青霉素还可减轻由高脂饮食诱导的葡萄糖抵抗、胰岛素抵抗和肝组织脂肪变。

NAFLD的严重程度与肠道菌群失调密切相关，即高脂饮食引起肠道通透性增加，导致肠源性细菌产物LPS等积累引起持续的、低程度的肝脏炎症[9]。Chemerin是机体发生胰岛素抵抗和NAFLD的危险因素。据报道，Chemerin诱导的葡萄糖代谢紊乱与脓毒症患者应激性高血糖诱发的病死率密切相关[4]。因此，Chemerin在NAFLD发病过程中可能起到了降低机体胰岛素敏感性和增加肝脏炎症的作用。此外，肥胖患者的血清Chemerin水平明显高于正常人群，而进行减肥手术后，Chemerin水平急剧下降[10]。相反，GRUBEN等[11]报道在敲除CMKLR1不能缓解非酒精性脂肪肝炎的进展。然而，本研究的数据表明，Chemerin可提高KCs中CMKLR1表达，以及诱导炎症小体的激活。此外，Chemerin和CMKLR1在NAFLD小鼠模型均明显高于正常饲料喂养的小鼠。因此，笔者猜测，造成本研究结果与GRUBEN等报道的结果不一致的原因可能是饲养小鼠高脂饲料的配方和饲养时间。

PI3K/Akt通路参与巨噬细胞的活化、存活和分化的调节。而且，PI3K/Akt通路与感染、炎症、非酒精性脂肪肝等疾病的发生发展密切相关[12]。PI3K的亚基可诱导Toll样受体4区室化，减轻LPS诱导的炎性反应[13]。PI3K抑制剂可减少小鼠的脂肪储存和降低小鼠体质量[6]。同时，高脂饮食可诱导肝脏KCs中NLRP3炎症小体激活并增加KCs的炎症因子分泌[14]。NLRP3炎症小体通过激活caspase-1促进KC分泌IL-1β和IL-18，从而促进NAFLD的进展[14]。在本研究中，P13K抑制剂渥曼青霉素可抑制Chemerin诱导体外KCs NLRP3炎症小体的激活，并且减轻由高脂饮食诱导的肝脏脂肪变性。这些结果说明，PI3K抑制剂渥曼青霉素通过下调KCs的CMKLR1和NLRP3的表达缓解高脂饮食诱导的NAFLD。然而，本研究结果并没有充分的证据证明CMKLR1/NLRP3信号通路的存在。假设CMKLR1/NLRP3通路是确实存在，这意味着CMKLR1将可能通过核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)途径激活下游的NLRP3炎症小体。但是，BONDUE等[15]已报道TLR激动剂不能改变巨噬细胞中Chemerin及其受体CMKLR1介导的炎症因子分泌的水平。因此，本研究结果尚未建立Chemerin和NLRP3真正的连接机制，需要在CMKRL1敲除小鼠和NLRP3转基因小鼠上进行更深入的研究。

综上所述，Chemerin可提高KCs中NLRP3和caspase-1 p10的表达，并促进炎症因子分泌。而PI3K抑制剂渥曼青霉素通过下调CMKLR1和NLRP3的表达，从而抑制Chemerin诱导的炎症小体激活，以及减轻高脂饮食诱导的小鼠肝脏脂肪病变，这些发现可为NAFLD的防治提供新的思路。

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